大鼠提睾肌血管肽类免疫反应阳性神经纤维的分布

　　自20世纪80年代初至今，包括降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide' CGRP )、神经肽Y(neuropeptide Y'NPY)、5羟色胺(5-hydroxytryptamine'5-HT)、P物质(subst ance P'SP)和甲硫氨酸脑啡肽(methionine enkephalin'M-ENK)等一批对血管生理功能有重要 影响的神经活性物质被发现［1，2］，为微循环的神经调节增加了新的内容.大白鼠 提睾肌微循环研究动物模型是上述研究的重要材料和手段［3］，但其血管上的神经活性物质分布情况还未见报道.血管内皮细胞的生物学特性、功能及损伤均与微循环障碍有关［4，5］，上述各种活性物质是否对其产生影响还无形态学依据.我们拟采用大白鼠提睾肌模型，对神经活性物质在各级血管上的分布进行研究，为血管损伤后微循环障碍病理生理改变机制研究和完善利用大白鼠提睾肌血管微循环研究模型打下一定的基础.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　兔抗CGRP及NPY抗体(使用效价1∶5000)由英国Polak教授惠赠，S p'5-HT 及M-ENK(使用效价1∶3000)由第四军医大学组织胚胎教研室生产.生物素标记猪抗兔IgG抗 体(使用效价1∶800)及卵白素生物素复合物(ABC)，使用效价1∶200)为丹麦Dako公司产品. 3.3-四盐酸二胺基联苯胺(DAB)为美国Sigma公司产品.

　　1.2　方法　成年雄性SD大鼠30只，平均分为CGRP'NPY'SP'5-HT及M-ENK共5组. 所有动物均以10 g・L-1'ip戊巴比妥钠溶液麻醉，开胸后经主动脉插管， 依次灌入9 g・L-1生理盐水100 mL及30 g・L-1多聚甲醛磷酸缓冲液300 mL.切开一侧腹股沟区皮肤，显露提睾肌，从其腹侧剪开向两侧展开，将睾丸推入腹股沟深处.在肉眼和解剖镜下仔 细剥离提睾肌上的小动脉(精素外动脉)，在肉眼下，从动脉起始部，至末端分支共分3级.另一侧提睾肌展开后，以动脉为中心将肌片取下，剥除血管表面肌组织以显露动脉便于免疫组化反应. 所有组织置固定液后固定48 h. 免疫组织化学染色按ABC法操作.血管及组织片先入甲醇双氧水以去除内源性过氧化物酶活性，再入3 g・L-1牛血清Triton液封闭1 h. 各组材料分别依次进兔抗CGRP' NPY' SP'5-HT及M-ENK抗血清、生物素标记猪抗兔IgG血清及卵白素-生物素复合物，最后以DAB呈色反 应20 min. 在染色过程中，每次进入抗血清前均以PBS缓冲液震荡漂洗3遍，每遍5 min. 进 入 抗血清后，先于恒温箱37℃孵育30 min，后置4℃冰箱过夜.用PBS和正常牛血清分别代替第 一抗体，用PBS代替第二抗体或ABC免疫复合物进行代替试验以做对照.

　　统计学处理:用交点计数法进行半定量计数：在×10 Olympus目镜下，计数与纤维长轴垂直的任一0.1 mm目镜网格线上纤维相交数量，每个血管分支任选3个视野同法计数，其平均值为本段血管神经纤维的密度. 平均数标准差以X±s表示，方差t检验进行统计学处理.

　　2　结果

　　提睾肌动脉及带血管组织片经ABC法染色后，各抗体免疫阳性纤维呈金黄色或淡黄色，各抗体着色一致，背景染色浅淡. 对照试验均为阴性.

　　2.1　CGRP阳性纤维和终末的分布特点　CGRP阳性纤维和终末广泛分布于提睾肌动脉各级分支中，但随着动脉的分支阳性纤维和终末明显减少'各级分支间阳性纤维和终末数量差别明显(P＜0.01'Tab 1). 在第1级分支，阳性纤维和终末呈浓密颗粒状，局部呈浓度斑块状 .所有阳性纤维围绕动脉形成网状分布，其中有线状和串珠状结构(Fig1). 在稍细的第2 级分支中，阳性纤维有所减少，其形态与第1级分支相同(Fig2). 至第3级分支以下，阳性纤维和终末明显减少，但颗粒状、线状、串珠状和网状纤维的很明显，其中呈网状和与血管长轴垂直之横行排列纤维也常见到(Fig 3). 在10 μm以下毛细血管壁上仍能见到分散呈颗 粒状阳性终末，局部可见色较淡之网状纤维分布.在毛细血管分叉处环绕该处之阳性纤维更 为显著(Fig 4).