丙型肝炎实验室技术研究进展

    一、抗-HCV检测

    1989年5月，美国Chiron公司用分子克隆法分离到一个能表达NANB肝炎病毒特异性蛋白的cDNA克隆5-1-1。又将3个与5-1-1有共同ORF的重叠克隆连接起来建立了另一个克隆C100。C100与超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重组表达的多肽即C100-3。完整的C100-3多肽的N端有154个SOD氨基酸，5个由EcoRⅠ位点人工接头表达的氨基酸和363个HCV C100 cDNA编码的氨基酸；在其C端还有5个MS2的氨基酸。

    HCV C100-3抗体检测系统，是最早应用的检测方法。世界各地关于HCV在各种人群中的感染率，基本上都是来自这种试剂盒的检测。检测结果证明，HCV是世界上几乎所有输血后非甲非乙型肝炎和部分散发性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由于C100只含363个氨基酸，而HCV基因组编码的蛋白有长达3010个氨基酸。因此C100-3抗原-抗体系统只代表整个HCV抗原抗体系统的一小部分，所以敏感性不高，抗C100-3出现也太晚，不适于早期诊断，有些病人根本不出现。而PCR方法却可检出HCV RNA，但有一定的漏检率。该方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此，当人体存有抗-SOD时常常出现假阳性。

    随着HCV基因序列的阐明，人们发现C区基因编码蛋白较E区和某些非结构区蛋白都保守，因此，用C区基因产物检测HCV抗体显得更加合理，于是相继建立了一些新的检测方法，试图克服C100抗原的某些缺陷，称之为第二代抗-HCV试剂。

    第二代重组基因多肽检测抗-HCV的ELISA技术是在原包被抗原 加入了核心抗原C22-3、C120、C11。和第一代试剂(C100-3)相比，第二代试剂具有检出率高(可提高25-30%)，而且抗体出现提早到16-60天。由于重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假阳性，问题于是激发人们建立人工合成肽段检测抗-HCV的新试剂。

    我所用中国北方地区HCV全基因序列，根据文献开发的预测蛋白理化性质及二级结构和抗原决定簇可能位点的序列软件，完成了HCV全基因序列的亲水性、亲近性、移动性分析，已预测到HCV抗原决定簇的位点。先对研制的C区3个寡肽(CPA、CP36、CP20)进行了抗原活性比较并初步应用于临床，同时与日本基因工程C区表达多肽C11进行比较。CP8+CP36阳性率与C11的阳性率无明显差异，符合率为87.6%。用本所建立的双PCR试验，比较82例抗-CP与HCV RNA的检测结果，符合率为87.5%。

    二、HCV RNA的检测：

    聚合酶链反应是目前分子生物学中最敏感的方法，样品中只要有一个拷贝的HCV序列就有可能被检出。由于HCV在被感染者体内浓度很低，不能用一般的免疫学技术检测病人血清中的抗原，目前只能用逆转录DNA PCR(RT-PCR)才能检测到血清中的HCV RNA。PCR技术有许多优点：1、特异性强 抗-HCV阳性不能直接说明受检者体内当时HCV是否存在，而PCR所检的HCV RNA可作为有无传染性的直接指标。2、敏感性高 可发现抗-HCV阴性者HCV感染。3、阳性出现早 可在ALT增高的同时检出。黑猩猩感染HCV后第三天即可在血清中检出HCV RNA。4、应用较广泛 可检测组织和体液中RNA。但操作程序较复杂，技术要求严格，试验成本高，所以只限于有条件的实验室使用。1991年我所建立了一项直接检测HCV PCR的双重PCR法，亦可称“一步法”。特点是微量(可从100μL血清中提到RNA)、简便(不用低温超速离心机等设备)、快速(从提取RNA逆转录可在4小时完成)、减少Rnase污染，1-2天内可发报告。由于PCR的诸多优点，只要不断的改进方法，使之更趋简便、快速，必将成为HCV感染诊断的重要手段。

    我所最近的研究结果表明，在原RT-PCT的基础上再进行定量PCR，其方法是在样品PCR反应混合液内加入3HdTTP掺入，液闪法测定3H掺入的CPM值以纯化已知浓度的cDNAsfuw(10pg/每管30Ul)，再计算待测血清中RNA的动态变化。初步研究结果发现，在治疗前后血清中RNA的深度变化较大。2例病人用α-干扰素治疗的病人中，虽然血清ALT转为正常，但血清中的RNA含量变化不大。提示该方法对丙型肝炎的疗效观察有一定的参考价值。