揭示癌细胞致命处“预见性化疗”闯新路

    手术、化疗、放疗是治疗癌症的三种主要手段，其中化疗最为常用，在治疗肿瘤过程中发挥着重要的作用。大部分化疗药物通过造成细胞DNA损伤而杀伤肿瘤细胞：如有的化疗药物造成DNA复制障碍；有的药物会嵌入到DNA双螺旋中两个碱基平面之间，造成DNA链断裂；有的药物引起DNA－蛋白质交联等。

    为什么同一种化疗药物对不同的癌症患者个体疗效不同？肿瘤细胞的耐药性如何分布？怎
样才能发现？其耐药性是由什么决定的？能否采用某种方法抑制其耐药性？军事医学科学院章扬培教授带领他的博士生们，历经12年的研究，揭示出细胞内的O6－甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（简称甲基转移酶MGMT），证明这是决定肿瘤细胞对亚硝脲类药物产生耐药性的分子基础。

    亚硝脲类化合物是烷化剂中的一大类，常用的有嘧啶亚硝脲、双氯乙基亚硝脲、环氯乙基亚硝脲、链脲菌素等。亚硝脲类药物由于其高度脂溶性，容易通过血脑屏障，是治疗脑瘤的首选药物，并常用于其他各种肿瘤的化疗，如脑脊髓转移、白血病、何杰森氏病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、胃癌、食管癌及网状细胞肉瘤等。亚硝脲类药物可在肿瘤细胞内释放出活泼的烷化基团，造成肿瘤细胞的DNA损伤。其中最严重的损伤是DNA鸟嘌呤碱基第6位氧原子烷基化，产生O6－烷基鸟嘌呤－DNA，并可进一步引起碱基错配、DNA链断裂和链间交联，最终导致肿瘤细胞死亡。

    中国人肿瘤细胞的耐药性
    我们测定了20株中国人肿瘤细胞，包括肝癌4株、肺癌4株、鼻咽癌2株、脑瘤2株、胃癌2株，恶性黑色素瘤、直肠癌、舌癌、乳腺癌、食管癌和宫颈癌各1株的MGMT酶活性，及经使用亚硝脲类药物（ACNU和BCNU）处理后的细胞存活率。实验证明，如果用细胞存活率为10％时所对应的药物浓度（D10值）作为衡量细胞对药物敏感性的指标，细胞D10值与MGMT酶活性之间有很好的线性关系，即MGMT酶活性高的细胞对亚硝脲有抗性，MGMT酶活低的细胞对亚硝脲药物敏感。这一研究成果说明，MGMT酶活性高低是决定肿瘤细胞对亚硝脲敏感性的分子基础。

    分别将MGMT低的HeLaMR和中国人Cc801宫颈癌细胞接种到裸鼠左胯皮下，把相同数量的MGMT高的HeLaS3和SMMC－7721肝癌细胞接种到裸鼠右胯皮下，待成瘤后，按每克鼠体重腹腔注射25μgACNU的剂量进行治疗，或将ACNU的剂量提高到50μg。试验结果显示：MGMF低者，HeLaMR和Cc801肿瘤移植物消失，继续观察1个月未见复发；而ACNU对MGMT高的肿瘤移植物无治疗效果。光学显微镜和电子显微镜检查证明，从裸鼠体内剥离出的治愈的MGMT低的肿瘤残存物中，仅能见到明显坏死的细胞和少量纤维细胞或脂肪细胞。这充分说明ACNU对MGMT低的肿瘤细胞有很强的杀伤作用。研究提示，如果能确定肿瘤细胞中MGMT酶活性低，就可能使用ACNU、BCNU一类的亚硝脲药物进行预见性的有效的化疗。

    分析74例不同类型的肿瘤组织中MGMT酶活性，发现在这些肿瘤中，MGMT酶活性由高到低的顺序为：乳腺癌＞胃癌＞小细胞肺癌＞非小细胞肺癌＞肾癌＞脑瘤＞食管癌＞结肠癌＞恶性黑色素瘤。这种组织分布规律性与临床使用亚硝脲治疗肿瘤的经验基本吻合，同时也观察到即使在同种肿瘤中MGMT酶活性也有个体差异。在74例病例的标本中有6例MGMT酶活性极低，包括食管癌3例，肺腺癌、脑胶质母细胞瘤和结肠癌各1例，如果对这几例患者使用亚硝脲药物治疗，也可能获得满意的疗效。对那些MGMT酶活性高的肿瘤，如能设法降低其MGMT酶活水平，就有可能使用亚硝脲有效治疗。

    经深入比较6株MGMT高（Mer＋型）与2株MGMT低（Mer－型）肿瘤细胞在基因结构与表达水平上的不同，研究显示，MGMT的mRNA表达是Mer＋型肿瘤细胞对亚硝脲产生耐药性的关键原因。

    我们选用3株Mer＋型肿瘤细胞为实验材料，这3株细胞的MGMT活性均较高，因此对ACNU和BCNU表现出不同程度的耐药性。使用链脲菌素（简写STZ）于37℃处理1小时后，3株Mer＋型细胞的MGMT活性明显降低。动物实验也证明，如先用STZ处理实验动物，然后再使用ACNU治疗，可将单独使用ACNU治疗无效的HeLaS3肿瘤细胞移植物有效地治疗。实验结果充分证明，使用合适浓度的链脲菌素可以有效地克服Mer＋型肿瘤细胞对亚硝脲类药物的耐药性，为临床开展STZ和ACNU联合化疗提供了参考和依据。

    耐药性昭示抗癌疗效
    在实验室工作的基础上，我们与解放军第307医院、中日友好医院合作，对60名使用亚硝脲（ACNU或BCNU）治疗的脑瘤患者肿瘤组织中MGMT活性高低与治疗效果之间的关系进行了分析。结果表明：使用亚硝脲药物对30名MGMT活性低或较低的脑瘤患者治疗效果好，其中26名治疗效果甚好；而25名MGMT活性较高的患者，使用亚硝脲治疗效果不明显，多数复发；6名MGMT活性很高的患者，亚硝脲治疗无效，全部死亡。这一实验结果充分证明，MGMT低的肿瘤病人细胞内缺乏对抗亚硝脲药物的机制，因而使用亚硝脲疗效显著；那些MGMT高的肿瘤病人，则因其具有修复亚硝脲药物杀伤肿瘤细胞的机制，对抗亚硝脲的杀伤作用，治疗无效。

    我们还与中日友好医院左焕琮教授合作，对MGMT高的、单独使用亚硝脲治疗无效的难治性脑瘤病人，开展了STZ伍用ACNU的临床治疗实验，共观察了8个病例。病例选择标准是：复发恶性脑瘤，经CT扫描证实；单独使用AC－NU进行颈动脉灌注治疗无效；具有可评价的病灶；预期存活大于12周；距上次ACNU化疗至少6周，且肝肾功能正常。

    治疗方案采用STZ和ACNU，均经患侧颈动脉灌注给药，STZ灌注1小时后，再同样灌注ACNU，重复给药间隔最少12周，疗效由CT扫描判定。观察结果令人鼓舞，8例对ACNU呈耐药性反应的患者，1例达到CR（可测肿瘤全部消失），2例达到PR（肿瘤体积消失在50％以上），4例NC（瘤体积消退＜50％），1例PD（无效，瘤体积增加＞25％）。CR加PR达37.5％（3／8）这一结果表明，使用STZ可以克服部分脑瘤患者对ACNU的耐药性，STZ与ACNU联合使用可以收到理想的化疗结果。

    准确快速测定酶活性
    我们在系统研究了肿瘤细胞内MGMT活性高低与亚硝脲药物治疗关系的基础上，制备出抗MGMT单克隆抗体，并研制出MGMT诊断试剂盒。经中国医学科学院肿瘤医院、北京肿瘤医院、中日友好医院、解放军307医院等6家单位的临床使用考核，证明试剂盒对诊断肿瘤细胞中MGMT酶活性具有特异性强、操作简单、快速等特点。

    试剂盒，临床考核分析了1175名经确诊为肿瘤病人的病理标本，其中包括头颈部肿瘤、肠癌、乳腺癌、胃癌、生殖系肿瘤、软组织肿瘤、甲状腺癌及脑瘤等。在1175例检测的病理标本中，强阳性290例，占24.68％；阳性517例，占44.00％；可疑（介于阴性与阳性之间）188例，占16.00％；阴性180例，占15.32％。

    在系统研究肿瘤细胞中MGMT活性与其对亚硝脲药物耐药性关系的基础上，我们在国内外率先提出了以分析肿瘤细胞MGMT酶活性为依据，以调节MGMT活性及基因表达水平为手段，克服肿瘤细胞耐药性，合理使用亚硝脲药物，对肿瘤进行预见性化疗的新方案。