核癌蛋白的表达活化

    肿瘤抑制基因与胃癌生物学行为的关系
    1.肿瘤抑制基因的发展 5.2DCC基因的检查方法
    2.肿瘤抑制基因的种类 5.3DCC基因在胃肠肿瘤中的异常表现
    3.肿瘤抑制基因的基本功能 6.APC、MCC基因与胃癌
    4.p53基因与胃癌 6.1APC、MCC基因的结构与功能
    4.1p53基因的结构和表达 6.2 APC、MCC基因的检查方法
    4.2野生型p53的生物学功能 6.3 APC、MCC基因在胃肠肿瘤中的变化
    4.3p53失活机理 7.研究肿瘤抑制基因的意义
    4.4p53基因检查方法 7.1有助于揭开肿瘤发生的奥秘
    4.5p53基因在胃癌组织中的变化 7.2为肿瘤基因治疗提供可能的途径
    5.DCC基因与胃癌 7.3促进肿瘤的早期诊断
    5.1DCC基因的结构与功能
　
    本章在全面叙述了肿瘤抑制基因的发现、种类和基本功能的基础上，阐述了p53基因在胃癌发生、演进及转移中的作用，重点讨论了DCC、APC和MCC三种肿瘤抑制基因的研究现状，以及它们在胃肠肿瘤中的变化规律。最后，综述了肿瘤抑制基因在恶性肿瘤发生中的意义，以及肿瘤基因诊断和治疗方面的新方法、新思路。

    肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）又称抑癌基因、抗癌基因，是正常细胞增殖的重要稳定因素。近年来的研究表明正常细胞向肿瘤细胞的演变以及恶性肿瘤的发生、发展，主要是癌基因和肿瘤抑制基因结构、功能、表达调控异常的结果。目前，对肿瘤抑制基因的研究已经成为继癌基因之后肿瘤遗传学分子生物学领域的前沿和热点。这一领域的研究对最终揭开细胞增殖、分化和癌变的奥秘、实现肿瘤有效的基因治疗，具有重大理论和实际意义。

    1.肿瘤抑制基因的发现
    肿瘤抑制基因存在的假设早在20多年前就已提出，但人类第一个肿瘤抑制基因的克隆和鉴定直到1986年才获得成功。肿瘤抑制基因存在的证据主要来源于以下三个方面的研究：

    (1)体细胞杂交正常细胞和肿瘤细胞杂交后几乎都产生非肿瘤杂种细胞，这说明正常细胞可以提供能抑制肿瘤表型的遗传信息。换言之，肿瘤细胞缺乏这种遗传信息从而使正常细胞转变为肿瘤细胞。这些杂种细胞的核型不稳定，经常有染色体丢失。当来自正常细胞的染色体丢失后，杂种细胞又可以回复成为肿瘤细胞。发现致癌转变与特定正常染色体的丢失相关之后推测：这些染色体带有肿瘤细胞基因组中丢失的基因，正是这些基因能使癌细胞正常化。

    (2)人类遗传学研究Knudson在研究视网膜母细胞瘤时发现肿瘤细胞中缺失13号染色体长臂的14区。经一系列遗传分析发现家族性疾病患者位于13q14的Rb（retinoblastoma susceptibility gene）基因在发病前已有一个等位基因失活。如果突变使另一个等位基因也失活，那么，将发生肿瘤。对散发性疾病患者必须经过两次突变才能引发肿瘤。这些突变的性质清楚之后，人们将这项工作与肿瘤抑制基因联系起来，发现Rb基因是一种肿瘤抑制基因。

    (3)分析肿瘤细胞基因杂合型缺失等位基因的基因型由杂合状态变为半合性（hemizygosity）、纯合性（homozygosity）或零合性（nullizagosity）称为杂合型缺失（loss of heterozygosity）。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段丢失。业已证实，某些野生型基因的特异性丢失或失活，保留或复制了突变型等位基因，与特定肿瘤的发生和发展有因果关系。因此检查出这些基因座位的杂合型缺失，对发现肿瘤抑制基因有十分重要的提示价值。实际上多数肿瘤抑制基因都是通过这种方法粗筛的。

    2.肿瘤抑制基因的种类
    自从肿瘤抑制基因Rb克隆鉴定以来，逐渐有许多基因被克隆鉴定（表3-1）。

    表3-1　已命名的肿瘤抑制基因
    名称
    染色体定位
    功能
    相关肿瘤
 
    视网膜母细胞瘤
    Rb
    13q14
    转录因子
    成骨肉瘤
    软组织肉瘤
    小细胞肺癌等
    乳腺癌
    p53
    17p13
    转录因子
    结肠癌
    肺　癌
    胃　癌等
    WT1
    11p13
    转录因子
    肾肿瘤
    NF1
    11q11
    神经纤维瘤
    结直肠癌
    DCC
    18q21
    细胞粘性
    食道癌
    前列腺癌
    胰腺癌、胃癌等
    结肠癌
    APC
    15q21
    G蛋白活化
    肺　癌
    食道癌、胃癌等
    结肠癌
    MCC
    5q21
    G蛋白活化
    肺　癌
    食道癌、胃癌等
    PTP
    3p21
    酪蛋白磷酸化酶
    肾细胞癌等
    纤维母细胞瘤
    VHL
    3p25
    希佩尔.道林病
    Krev1
    1p
    脑神经痛
    MTS1
    9p21
    cdk4
    食道癌
    胰腺癌

    由于肿瘤抑制基因为隐性癌基因，分离克隆与鉴定工作较困难，目前分离到的基因尚少。基于对肿瘤抑制基因的推论，估计其数量与基因相当。

    3.肿瘤抑制基因的基本功能
    研究肿瘤抑制基因的关键是了解它们的正常生理功能和为什么它们失活能够导致细胞恶变。然而人们对此所知不多。有一种解释肿瘤抑制基因及其产物正常功能的观点：它们是细胞内信号途径的一部分，能使细胞接受并处理来自周围的抑制生长信号。当细胞丢失这信号网络的关键组分后，即使细胞周围存在抑制生长信号，细胞也不能对这些信号做出反应。从这个意义上讲，各种肿瘤抑制基因的产物不应被看作内在抑制细胞因子，它们是来自细胞内外抑制生长信号的传导者。这一模型为肿瘤抑制基因下了可操作的定义；一个遗传因子，它的丢失或失活使细胞表现为这样或那样的致瘤生长失调表型。此定义排除了导入细胞后抑制或毒害细胞的基因和过度表达的基因。

    从整体而言，人类对肿瘤抑制基因生物学功能的了解还很精浅，缺乏系统性。目前已知肿瘤抑制基因可能具有的功能主要有：①维持细胞稳定；②调节细胞生长；③诱导终末分化；④触发衰老、诱导细胞程序性死亡；⑤抑制蛋白酶活性；⑥改变DNA甲基化酶活性；⑦调节组织相容性抗原；⑧促进细胞间联系。

    4. p53基因与胃癌
    p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。1988年以前p53一直被认为是细胞原癌基因。早期的研究发现p53蛋白对细胞的增殖和转化有促进作用。静止期细胞经有丝分裂素刺激后，p53蛋白的合成显著增加，提示细胞进入分裂状态与p53有关。体外细胞转化实验中，p53蛋白能促进ras基因的活化，并进一步引起细胞转化。在转化的细胞中p53基因表达水平也明显提高。因此，p53被看作原癌基因。但随着研究的深入，发现“原癌基因p53”并不是野生型，而是突变体。野生型p53基因抑制肿瘤形成的直接证据来自Finlay等的基因转染实验。他们将野生型p53与癌基因ras或突变型p53共同转染细胞株。结果野生型p53能够有效地抑制细胞的恶性转化，说明野生型p53 是一种肿瘤抑制基因。

    4.1 p53基因的结构和表达
    人类p53基因定位于17p13.1，全长约20kb，由11个外显子和10个内含子组成，转录成2.5kb mRNA，编码393个氨基酸的蛋白质，分子量为53kD。P53蛋白可与DNA结合，为磷酸化核蛋白。蛋白质的N端为酸性区。约1-80位氨基酸残基，C端为碱性区，319-393位氨基酸残基。正常的p53蛋白在细胞中易被水解，半衰期为20分钟，突变型p53蛋白半衰期可延长至1.1，7.0小时。P53有5个高度保守区，第13 19，117-142，171-192，236-258，270 286编码区。大量研究表明，人类肿瘤中p53突变主要发生于以上高度保守的区域内。

    4.2野生型p53的生物学功能
    目前认为野生型p53在细胞损伤后的修复过程中发挥重要作用。正常p53的功能像“分子警察（molecular policeman）”监视着基因组DNA的完整性。在细胞受到射线或某些药物作用而发生DNA损伤时，p53蛋白能使细胞分裂终止在G1/S期，以使细胞有足够的时间修复损伤，恢复正常状态。若不能修复，野生型p53还能启动细胞的凋零（apoptosis）过程引发细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞产生。

    4.3p53失活机理
    p53基因突变是其功能丧失的主要原因。通过对肿瘤中大量突变体分析，证实大部分突变位于p53基因高度保守的区域，且多数为错义突变。体内外实验发现突变体失去了对特异位点的结合能力。此外，突变体还可以改变p53的空间构像。在功能上，突变体可以表现为以下两种情况：一是显性阴性作用（dominant negative effect），即突变型p53蛋白能使同时表达的野生型p53蛋白失活；二是显性致癌作用（dominant oncogenic effect），即某些p53突变体在丧失正常功能的同时具有致癌作用，成为癌基因。

    一些蛋白质能与p53蛋白作用，导致p53蛋白丧失正常的生物学功能。这些蛋白包括mdm-2、SV40大T抗原、腺病毒E1B及HPVE6蛋白等，其中V40大T抗原、腺病毒E1B及HPVE6。蛋白与p53蛋白结合后可抑制p53蛋白对其它基因的转录调控，或促进p53降解而使其失活；而位于12q12-13的mdm-2癌基因，其产物过表达可见人类软组织肉瘤中，可能通过抑制p53蛋白的途径而参与肿瘤的发生和发展过程。

    4.4 p53基因检查方法
    p53基因在肿瘤组织中可表现为基因缺失和基因突变。基因缺失的检查主要采用Southern杂交法：首先提取肿瘤组织及同一患者的正常组织基因组DNA，经酶切、电泳，将DNA转移至硝酸纤维素膜，再与同位素标记的特异性p53探针杂交，放射自显影。

    基因突变的检查主要采用聚合酶链反应（PCR）辅以其它有关的检查方法，如PCR-RFLP（限制性片段长度多态性分析），此法的原理是p53基因突变常引起某一区域限制性内切酶识别位点消失或因突变而产生新的酶切位点。用适当的酶切时，突变的基因会产生与正常基因长度不同的片段。PCR-SSCP（单链构象多态性分析）是检查p53基因突变的最常用方法，原理是在特定的电泳环境下DNA片段的迁移率主要取决于DNA的空间构象，而后者由组成DNA的碱基序列所决定，一个碱基的差别即足以改变其空间构象，故电泳时DNA区带迁移率差异表现碱基异常。

    采用免疫组化技术，能够检查p53突变蛋白的表达。野生型p53蛋白在细胞中表达量低、半衰期短，以免疫组化的敏感性无法检出如此微量的抗原成分，而突变型p53蛋白的半衰期显著延长，可以检出。故采用免疫组化法检出的p53蛋白皆可认为是突变型p53蛋白。目前常用的抗体有P421、P1801和CM-1等。

    4.5 p53基因在胃癌组织中的变化
    p53基因是迄今发现在胃癌组织中最常发生异常的肿瘤抑制基因。该基因结构的改变包括点突变和等位基因缺失，导致突变蛋白在细胞中的累积及正常p53功能的丧失。

    p53基因突变与不同组织类型的胃癌有一定关系。Uchino等通过采用PCR-SSCP技术检查了59例胃癌p53基因突变，发现在早期胃癌组、粘液细胞癌和呈弥散性生长的低分化腺癌无p53基因突变，而乳头状腺癌、管状腺癌等分化较好的癌组织p53突变率为37％。进展期胃癌组也有类似的规律。采用免疫组化法检查149例胃癌p53突变蛋白的表达，结果34/99例进展期胃癌、11/50例早期癌呈阳性表达，其中以乳头状腺癌、分化较好的管状腺癌和低分化巢状、管状腺癌为主。

    p53基因突变与胃癌的转移及不良的预后有关。一般认为，p53突变蛋白表达阳性的胃癌，转移的可能性大，预后差。Kim等通过分析15例原发性胃癌和5例转移性胃癌细胞的p53基因结构，发现15例原发癌中只有1例存在突变，而5例转移性胃癌细胞系均有突变发生。在所有突变中，有4例发生于高度保守的区域或SV40大T抗原结合部位。作者认为p53基因突变在胃癌转移中起一定作用。

    我们采用免疫组化技术检查了胃癌p53突变蛋白的表达。结果在62例胃癌组织中，34例表达阳性，占54.8％。阳性物质主要分布于细胞核，部分在细胞中呈弥散分布。p53突变蛋白的表达与肿瘤分化程度有一定关系：随着分化程度的降低，其表达也趋于下降。在已发生癌周淋巴结转移的48例癌组织中，p53表达阳性者27例，占56.3％，未发生转移的14例中有7例阳性，占50.0％，两者无显著性差异。但是在已发生远处器官转移的11例胃癌（肝转移5例、侵犯胰腺4例、腹腔种植转移2例）中，p53表达阳性者8例，占72.7％，显著高于未转移组和仅发生癌周淋巴结转移组（P＜0.01）。

    最近英国学者Joypaul等通过检查206例胃癌p53突变蛋白的表达，发现46％（94/206）的癌组织p53染色阳性。p53突变蛋白表达与肿瘤分级、生长方式、癌周淋巴结转移无明显相关，但是与患者的生存期相关显著：有p53阳性表达的患者5年生存期只有3％，而p53表达阴性者5年生存期却有16％。Martin等的研究结果也表明p53突变蛋白表达预示着预后不良。

    综上所述，p53基因是胃癌发生和发展的一个重要因素，也是迄今发现的与胃癌关系最密切的肿瘤抑制基因。该基因在肿瘤发生以及基因诊断、治疗领域的任何新进展，都将有助于增加对胃癌的认识，同时对胃癌的诊断和治疗有所启示。

    5.DCC基因与胃癌
    近年研究发现18号染色体长臂（18q）在结直肠癌组织中经常发生缺失，缺失率高达70％以上，不仅如此，在晚期结直肠腺瘤中也有近一半发生缺失。如此高的缺失率提示该染色体部位存在肿瘤抑制基因，它的缺失在结直肠腺瘤向腺癌演变过程中发挥一定作用。为了发现并鉴定位于18q的肿瘤抑制基因，Vogelstein小组采用针对18q的多种基因探针对大量结直肠癌组织做了检查，发现探针p15-65（18q21.3）能够检出异常的基因结构。以此为基础经过大量克隆与筛选，于1990年鉴定出一种新的肿瘤抑制基因，命名为DCC（deleted in colorectal carcinoma）。

    5.1 DCC基因的结构与功能
    DCC基因定位于18q21.3。最初的研究曾推测该基因全长约300—400kb，最近研究证实DCC基因全长为1400kb，含29个外显子，其cDNA编码1447

    个氨基酸的跨膜蛋白，含有转录启始部位、信号肽基因以及编码跨膜蛋白的基因区域。DCC基因经转录和翻译产生的DCC蛋白主要由细胞浆内（325个氨基酸）和细胞浆外（1100个氨基酸）两部分组成。胞浆内部分的多肽与已知的细胞内多肽没有相似结构，细胞外多肽的氨基酸顺序和神经和神经细胞粘附分子（N-CAM）及其它相关的细胞表面糖蛋白十分相似。DCC蛋白中有两个与N-CAM等糖蛋白结构十分相似的区域，一个是与免疫球蛋白相似的结构区域，DCC蛋白共有4个这样的结构，因此可以将DCC蛋白看成是免疫球蛋白基因超家族的一个成员；另一个是与Ⅲ型纤维连接蛋白相似的结构区域，DCC蛋白含有6个这样的结构。由于已知CAM及其它细胞表面糖蛋白在细胞-细胞、细胞-基质之间的粘附中起重要作用，推测DCC蛋白很可能通过与CAM等糖蛋白相似的机理参与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用，使细胞维持正常的生长和分化方式。当DCC基因发生缺失和突变之后，DCC蛋白生成障碍，细胞生长和分化紊乱，促使细胞朝着恶性方向演变。虽然DCC基因的正常生理功能还不十分清楚，但目前已能肯定该基因是作为一种肿瘤抑制基因在体内发挥抑癌作用的。

    DCC基因作为肿瘤抑制基因的证据主要来自以下5方面的实验结果：①该基因在结直肠癌组织中经常发生缺失；②在结直肠癌及胰腺癌等肿瘤组织中的表达显著下降甚至不表达；③在癌组织中可发生突变；④将含DCC基因的18q转移至已知DCC基因缺失的结直肠癌细胞中，可使细胞的恶性表型显著降低；⑤通过构建DCC基因的特异性反义RNA，并将此RNA转入Rat-1纤维母细胞，可引起细胞生长速度明显加快，在裸鼠模型中可诱发癌变。该实验首次提供了DCC为肿瘤抑制基因的直接生物学证据。

    5.2 DCC基因的检查方法
    对DCC基因缺失的研究主要采用定位于DCC基因区域内的特异性探针进行Southern杂交和采用对DCC基因特定区域进行PCR等两种方法；对DCCmRNA表达则采用逆转录-PCR技术特异性地对外显子O和P之间的233bp范围的基因片段进行扩增。首先提取肿瘤及对照组织的RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，然后采用PCR技术扩增233bp范围的DCC基因片段，在此基础上采用Southern杂交或其它技术可进一步检查DCCmRNA的含量。由于DCC基因在人体多数组织中表达量很低，一些灵敏度较低的方法如Northern杂交、原位杂交等均不适用于DCCmRNA的检查。

    5.3 DCC基因在胃肠肿瘤中的异常表现
    结直肠癌结直肠癌组织中DCC基因的缺失率很高。用探针p15-65（定位于DCC基因内含子区域）检查，缺失率可达71％（29/41）。Vogelstein等采用5种18q探针对良恶性结直肠作了系列检查，结果癌组织中缺失率为73％（51/56），在进展期腺瘤中缺失率为47％（8/17），而在中、小腺瘤中低于10％。说明缺失主要发生于进展期腺瘤向腺癌演进阶段，这一发现也提示该基因在结直肠癌的早期诊断方面有一定价值。对家族性腺瘤样息肉（familial adenomatous polyposis，FAP）癌变的组织，情况则有所不同。DCC基因的缺失或表达下降出现得较晚，主要见于浸润性肿瘤。说明两者在癌变机理上有一定差别。

    DCC基因的缺失或表达下降与结直肠癌患者的预后有关。O扖onnell等比较了60例结直肠癌（Dukes B，C）患者17p（含p53基因）、18q（含DCC基因）缺失与肿瘤复发的关系，结果表明有18q基因缺失的患者复发出现较早，预后差。因此检查DCC基因缺失对预后判断有一定帮助。最近有人检查了DCC基因mRNA的表达，结果57％（17/30）出现表达下降，其中4例已发生肝转移的肿瘤均显示DCCmRNA表达降低。因此该基因表达下降也与预后有一定关系。

    胃癌对胃癌组织的18q及DCC基因缺失的研究目前已报道。曾有人采用OS-4探针对胃癌组织进行检查，结果缺失率不高，可能是胃癌组织含有较多基质干扰了实验结果的缘故。Uchino等对胃癌组织标本作了精心筛选，使癌细胞的比例占50％以上，并用4种18q基因探针（含DCC）同时检查，确认61％（14/23）的胃癌组织存在基因缺失。在23例胃癌中有5例为早期胃癌，其中4例发生缺失。说明DCC基因参与胃癌的早期发生。作者同时对DCC基因和p53基因作了对比，结果提示对胃癌而言，DCC基因缺失可能早于p53基因。我们通过检查12例胃癌及对照组织DCCmRNA含量，发现部分胃癌组织DCCmRNA显著低于对照组，进一步支持该基因参与胃癌发生的观点。

    6. APC、MCC基因与胃癌
    大约有40％的结直肠癌和散发性腺瘤组织存在第5号染色体长臂（5q）基因缺失。FAP组织中也经常有5q基因缺失。1991年在5q21位点上新确定了两个基因APC（adenomatous polyplsis coli）和MCC（mutated in colorectal carcinoma），它们在结直肠肿瘤的早期发生中起一定作用。

    6.1 APC、MCC基因的结构与功能
    APC和MCC基因都定位于5q21，它们之间相隔150kb。MCC基因含17个外显子，16个内含子，cDNA由4181个核苷酸组成，产物分子量为93kD蛋白。MCC蛋白的多肽链中有一个含19个氨基酸的结构区域，与G蛋白偶联的m3型荤毒碱乙酰胆碱受体（m3mAChR）的部分氨基酸顺序十分相似。近年研究发现G蛋白的激活受mAChR亚型的控制，其中mAChR亚型的结构中含21个氨基酸的区域对G蛋白的特异性激活起关键作用。MCC蛋白中与mAChR相似的19个氨基酸恰好在这个21个氨基酸区内，因此MCC蛋白很可能通过与G蛋白结合，影响或抑制G蛋白活性，进而参与和调节细胞内正常的信息传递。

    APC基因cDNA由8532个核苷酸组成。该基因共有15个外显子，其中第15个外显子最大（6571bp）占该基因编码区的77％。APC完整的编码蛋白含2843个氨基酸。APC蛋白可分为两个主要区域：靠近氨基端的部分含有大量亮氨酸残基并具有与肌球蛋白、中间丝蛋白局部同源的序列；靠近羧基端的区域含有较多的丝氨酸残基、酸性氨基酸和脯氨酸残基。这两个区域内存在螺旋-螺旋（coiled-coils）结构。关于APC蛋白的生物学功能尚不明确。与DCC蛋白不同，APC蛋白不是跨膜蛋白，而是细胞浆内蛋白质。在结构上有一部分与MCC蛋白相似，均与mAChR和G蛋白结合区同源，因此在功能上可能与MCC蛋白有类似之处。

    APC和MCC基因作为肿瘤抑制基因的依据主要有：上述两基因在肿瘤组织中经常出现突变、重排及缺失；将含APC、MCC基因的5q移入肿瘤细胞后，肿瘤细胞生长受到抑制。近年研究发现APC基因的突变是FAP发生的始动基因，因而对该基因的研究较为深入，并成为肿瘤抑制基因研究的一个新热点。但是该基因很长，给研究工作带来了很多困难。1993年Su等发现APC基因经常发生无义突变，使APC编码的蛋白提前终止形成剪切蛋白（truncated APC protein），该蛋白能够以显性阴性方式与野生型APC蛋白结合，干扰后者的正常功能。深入研究APC基因在肿瘤发生中的作用机理，对人类揭示肿瘤早期发生的奥秘将有一定的促进作用。目前对APC基因功能的研究尚在继续之中。

    6.2 APC、MCC基因的检查方法
    目前已建立了几种检查APC基因突变的方法。这里仅就笔者采用的检查胃癌APC、MCC基因杂合型缺失的方法作一简要叙述。

    在研究胃癌组织肿瘤抑制基因缺失过程中，首先遇到的困难是胃癌特别是浸润性胃癌中含有大量非癌的基质细胞，在提取肿瘤DNA时常受基质细胞DNA的严重污染，使检查结果无法真实反映肿瘤细胞本身的变化规律。为此，宜强调将癌细胞数占总数50％以上的癌组织视为合格标本。在筛选合格标本过程中，经常遇到癌细胞相对集中于组织切片一个或几个区域的情况，为了准确挑取癌细胞集中的部位，笔者建立了以染色的组织为模板的PCR方法，证实组织经常被苏木精-伊红或甲苯胺蓝染色后仍能进行有效的基因扩增。采用这种方法可显著提高标本的合格率，为进一步研究提供了方便条件。此外，在以福尔马林固定、石蜡包埋的胃癌组织为模板进行PCR时，经常遇到非特异性扩增现象，影响PCR产物的酶切及结果分析。为此，笔者建立了一种小体积蜡膜介导热启动PCR技术，使得引物与TaqDNA聚合酶在超过蜡膜融点（60℃）时才接触，在较高的温度下启动PCR反应，显著提高了扩增特异性。

    APC基因外显子10已被证实是该基因缺失经常发生的部位。通常扩增的区域为133bp，该区域有一个Rsa-Ⅰ酶切位点可将133bp切成85bp、8bp两条酶切带。根据酶切谱可判断是否存在APC基因杂合型缺失。若同一患者的正常组织出现133bp、85bp、48bp三条带而肿瘤组织只出现133bp单一条带或85bp、48bp两条带，为APC基因杂事型缺失。MCC基因外显子10为缺失好发部位，该部位可存在14bp的插入片段。若同一患者的正常组织出现79bp、93bp两条带，而肿瘤组织只存在其中一条带，为MCC基因杂合型缺失。

    6.3 APC、MCC基因在胃肠肿癌中的变化
    APC、MCC基因的发现较晚，对它们的研究主要集中于结直肠肿瘤，但近年来也报道了它们在胃癌中的异常改变。

    6.3.1 结直肠肿瘤FAP是一种常染色体显性遗传病，恶变率很高
    现已证实APC基因突变是该病发生的关键因素。

    6.3 APC、MCC基因在胃肠肿癌中的变化
    APC、MCC基因的发现较晚，对它们的研究主要集中于结直肠肿瘤，但近年来也报道了它们在胃癌中的异常改变。

    现已证实APC基因突变是该病发生的关键因素。突发发生于FAP患者的生殖细胞水平上，绝大多数为无义突变，导致APC蛋白缩短，形成剪切蛋白。目前已设计出检查剪切蛋白的有效方法，可用于FAP的诊断。在散发性结直肠肿瘤中，APC外显子11、MCC外显子10、15杂合型缺失率在50％以上。APC基因既可发生缺失，也发生体细胞突变。突变谱与FAP相似，大约65％的突变发生于1286-1513密码子之间，绝大多数突变导致基因产物缩短，形成剪切蛋白。腺瘤和腺癌的突变率接近，提示该基因在结直肠肿瘤发生的早期阶段发挥作用。

    胃癌
    在APC、MCC基因鉴定之前，有人采用位于5q35-ter的探针MS8对胃癌进行了基因缺失的检查，结果发现存在基因缺失。日本学者Horii等报道了胃癌APC基因突变的情况。他们采用PCr-RNase保护性分析实验在44例胃癌中发现3例突变，均发生于粘液细胞癌。其中一个是误义突变，一个是无义突变，还有一个发生了5个碱基缺失，引起框架移位（frame shift）导致APC产物提前中止。突变部位不在结直肠癌的突变好发区。

    1993年英国学者Mickie等首先报道了胃癌组织APC、MCC基因缺失的情况，发现上述两基因缺失与胃癌分化程度有一定关系，在未分化型腺癌中APC和MCC缺失率明显高于分化型腺癌。美国学者Rhyu等则通过对52例胃癌的检查，发现上述两基因的缺失与分化程度关系不大，APC基因外显子11缺失率为34％，MCC外显子10、12、15缺失率为33％。他们同时检查了胃粘膜不典型增生组织中的APC、MCC缺失情况，结果没有发现缺失。据此作者推测上述两基因缺失可能是胃癌发生的晚期事件。

    最近日本学者Tamura等报道了他们对30例胃腺瘤组织APC基因突变的检查结果，发现有6例腺瘤存在APC基因突变，突变的发生不随肿瘤大小和组织学类型改变而变化。由于在结直肠癌形成期间，APC基因突变之所以被认为是肿瘤发生的早期事件是因为在很小的腺癌中就可以查到突变，并且突变率并不随着结直肠腺瘤向腺癌的演变而上升。相应地，作者认为APC突变在胃癌中的作用可能与结直肠癌相似，是胃癌发生的早期事件，这一推论与Rhyu等的观点明显不同。为明确APC、MCC基因杂合型缺失与胃癌发生及生物学行为的关系，我们采用以PCR为基础的实验技术检查了APC基因外显子11、MCC基因外显子10杂合型缺失的情况，结果发现胃癌组织可发生上述两基因位点的缺失。初步研究表明，APC基因缺失与胃癌发生的部位、大小、浸润深度、周围淋巴结转移无明显关系，不同分化程度的胃癌也都可以出现缺失，在3例APC基因呈杂合型的早期胃癌中，1例发生缺失。

    综合以上研究结果，可以明确，在胃癌发生中APC、MCC基因异常是两个较常见的遗传学改变。APC基因异常既可以发生于胃腺瘤，又可以存在于早期胃癌中，在进展期胃癌中也可以出现，且三者阳性率相近，因此可以推测APC很可能在胃癌发生的早期发挥作用。

    7.研究肿瘤抑制基因的意义
    7.1有助于揭开肿瘤发生的奥秘
    长期以来，人类对肿瘤发生的基本过程所知甚少。近年来，肿瘤分子遗传学领域发展较快，对已鉴定的癌基因和肿瘤抑制基因致癌机理的了解不断加深，同时又有新基因被发现。现已明确：肿瘤的发生是癌基因激活、肿瘤抑制基因失活共同作用的结果。人们认识较充分的是结直肠癌的发生过程。结直肠上皮细胞中APC基因失活能引起细胞过度增生，这时还不是癌变，还需要一系列的基因改变，包括癌基因（k-ras）激活、肿瘤抑制基因（DCC、p53）失活等，多基因的累加最终导致细胞向恶性方向演变（图3-1）：在胃癌的发生中，同样有癌基因（Ha-ras）激活和肿瘤抑制基因失活（APC、DCC、p53）等改变，但是我们的异常改变在胃癌发生过程中是否起决定性作用，尚需加强研究。

    7.2为肿瘤基因治疗提供可能的途径
    目前与肿瘤抑制基因有关的肿瘤治疗设想主要有以下几个方面：
    (1)利用野生型肿瘤抑制基因导入细胞的方法治疗肿瘤。将Rb或p53基因导入有上述基因缺失的肿瘤细胞可使肿瘤细胞的恶性表型得以逆转，这为进一步的临床实验提供了细胞学依据。利用p53导入治疗晚期肿瘤病人在美国已经进入临床验证阶段。
    (2)指导新的抗癌药物合成。在明确肿瘤抑制基因的正常生理功能之后，可以设法合成新的生化制剂以替代肿瘤抑制基因所发挥的作用，使得该基因失活时也不致于使细胞向恶性方向演变。
    (3)利用免疫疫苗治疗肿瘤。肿瘤抑制基因常可发生突变。突变蛋白对个体来说都是特异性肿瘤多肽（oncopept-ides）。现在人们正努力寻找一种有效分离与合成这些肿瘤特异性的具有免疫原性的多肽，并设法提高其免疫原性，使之成为肿瘤排斥抗原，激活肿瘤自身的免疫系统，发挥特异性主动免疫效应杀伤肿瘤细胞。

    7.3促进肿瘤的早期诊断
    有些肿瘤抑制基因在细胞恶变之前或早期即已出现异常，并且这种异常改变具有高度的特异性。因此设法检测这些异常的改变可以作为肿瘤早期诊断甚至预测肿瘤发生的一种有效途径。FAP虽然是一种良性疾病，但有较高的癌变率。这种病人的家族成员患病的机率也较大。以往缺乏有效的检查及监控措施。自从明确APC基因在FAP发生中的作用以来，人们通过检查血细胞中APC基因是否存在突变，就可以使患者及家族成员在FAP癌变之前甚至症状出现之前得到诊断。APC基因突变的检查可采用对该基因不同区段分别进行PCR扩增，也可以采用体外合成蛋白检查（in vitro synthesized-protein assay）和等位基因特异性表达检查（allele-specific-expression assay）等技术。以上方法都可用于临床常规检查。