抑癌基因失活与胃癌的关系

    1 抑癌基因的基本概念
    抑癌基因或抗癌基因是一大类可抑制细胞生长，并能潜在抑制癌变作用的基因群，它仅在某一种特定细胞内起作用。如要确定某一种特定组织或恶性肿瘤的抑癌基因，必须具备以下条件：①在该癌的相应正常组织中必须有正常的表达；②在该种恶性肿瘤中应有所改变，如点突变，DNA片段或全基因缺失，以及表达缺陷；③将其转染该基因缺陷的恶性肿瘤细胞可部分或全部抑制其恶性表型。抑癌基因应有抑制细胞生长的作用，但具有抑制细胞生长的基因并非均属抑癌基因，如干扰素、TNF及其它细胞因子基因等。凋亡（Apoptosis）是细胞的程序性死亡（Pragrammed death），从广义来说，抑部基因应包括凋亡基因，但两者之间的功能可能并不相同，将有待进一步研究和阐明。由于癌发生是多病因引起的，并经历了多阶段的发展过程，因此，不同组织来源的癌涉及的基因群也可不尽相同，各组织的癌应有它特定的抑癌基因谱。不同组织恶性肿瘤的谱型间，有共同的基因群，也有各自组织特异的基因群。

    2 抑癌基因的失活方式
    研究表明，抑癌基因的失活会导致细胞恶性转化和肿瘤的发生。抗癌基因失活的主要方式为染色体等位基因缺失、突变、基因重排和失去控制的异常表达。对抑癌基因失活目前有三种假说：①等位基因隐性作用：该假说认为，失活的抑癌基因之等位基因在细胞中起隐性作用，即一个拷贝失活，另一个拷贝仍以野生型存在，细胞呈正常表型。只有当另一个拷贝失活后才导致肿瘤发生。对Rb等位基因的研究为该假说提供了有力证据。②抑癌基因的显性负作用（dominant negative）：认为抗癌基因突变的拷贝在另一野生型拷贝存在并表达的情况下，仍可使细胞出现恶性表型和癌变，并使野生型拷贝功能失活。这种作用称为显性负作用或反显性作用。如近年来证实突变型p53和APC蛋白分别能与野生型蛋白结合而使其失活，进而转化细胞。③单倍体不足假说（Haplo-insufficiency）：认为某些抗癌基因的表达水平十分重要，如果一个拷贝失活，另一个拷贝就可能不足以维持正常的细胞功能，从而导致肿瘤发生。如DCC基因一个拷贝缺失就可能使细胞粘膜附功能明显降低，进而丧失细胞接触抑制，使细胞克隆延伸或呈恶性表型。以上三种假说实际上反映了抗癌基因失活方式的复杂性。对多数抑癌基因来说，可能以多种方式失活并作用于细胞，导致恶性转化和肿瘤的发生。

    3 抑癌基因失活与胃癌
    （1）p53基因定位于染色体17p13.1，全长约20kb，由11个外显子和10个内含子组成。p53基因的mRNA为2.8kb，蛋白产物分子量为53kb，p53蛋白由393个氨基酸组成 ，有五个高度保守区，这些保守区可能是p53蛋白生物活性的关键部位。p53蛋白的生化功能为调节因子，对 细胞周期中的增殖细胞具有调控作用，能控制G0或G1期细胞进入S期，从而抑制细胞的增殖。正常p53基因的功能像“分子警察”（molecular police man），监视着细胞基因组的完整性。如DNA遭受损伤，p53基因即活化，发挥其生物学功能，使DNA复制终止，以使细胞有足够的时间修复损伤的DNA。若修复失败，则通过诱导程序性细胞死亡机制，阻止具有癌变倾向细胞的产生。p53基因突变多集中在四个高度保守区，即5-8外显子上。其在癌变过程中可能发生两次事件，其一为p53基因编码区的点突变，其二为剩余p53等位基因的缺失。点突变可能首先发生，通过反式灭活（transdominant inactivating）作用引起突变细胞克隆的增殖，接着发生野生型p53等位基因缺失，最后导致肿瘤的形成。p53基因突变除导致正常功能丧失外，一此突变同时还获得新的功能，如在与ras 基因共同转染试验中，多数p53突变体不但失去对细胞转化的抑制作用，反而加剧了细胞的转化。p53基因突变具有异质性，表现 为基因结构、转录和翻译等不同水平的突变。结构突变通常是碱基置换、移码突变或基因缺失等。碱基置换尽管只发生在一、二个碱基，但因其主要位于基因的功能区，而使氨基酸的组成发生变异，从而导致蛋白质功能的改变。p53基因转录和翻译水平的变异亦是突变的重要方式。

    正常情况下p53蛋白的半衰期甚短，而且极不稳定，一般方法很难检出，突变型p53蛋白稳定性增加，半衰期延长。突变型p53蛋白能通过显性抑制效应抑制野生型p53基因的激活或使其失活，从而引起细胞的转化和癌变。据分析，这种抑制作用可能是通过突变型p53蛋白与野生型p53蛋白结合，形成失活的寡聚复合物产生的，在部分肿瘤研究中已证实了突变型p53显性抑制效应的存在。晚近研究表明，p53蛋白可调解肿瘤细胞对化疗药物的反应性突变型p53白阳性细胞对化疗药物有更大的抗性。

    p53基因突变在各期胃癌均非常普遍，但较多地发生晚期胃癌及转移者。Kim等对原发胃癌及其转移的细胞系比较研究时发现，原发生胃癌有25%发生了p53基因突变，而胃癌转移者p53突变率达83%。Tamura等检测4例胃癌异倍体细胞4-8外显子，突变率为64%，2倍体细胞未见突变者，提示p53突变与DNA倍体改变有关，是胃癌的晚期改变。Uchino等对早期和进展期胃癌进行研究发现，碱基置换是胃癌最频繁的突变形式，并对p53基因突变的特征归纳为：①无论早期还是进展期胃癌，p53基因基因突变的位点并非集中在一个特异的外显子上，而是散分布于5-8外显子；②主要为单核苷酸置换，几乎所有单核苷酸置换突变都是错义和无义突变；③在胃癌突变系列中，可以普遍地观察到G：C向A：T的转换，它们几乎全部发生在CpG二核苷酸；④局限于粘膜内和粘膜下层的胃癌，p53基因突变选择性地发生于乳头状腺癌，高中分化管状腺癌和具有明显癌巢或灶性管状结构的低分化癌，其中早期癌的突变率为37%，进展期为42%，而18例早期印戒细胞癌和弥散生长的低分化癌则未检出p53基因突变。p53突变与大体形态学、组织学分类、淋巴结转移和肿瘤浸润深度间无明确关系。值得重视的是p53基因突变中最多见的G；C向A：T转换可以被MNNG诱发，而MNNG被认为是诱发胃癌的一种致癌剂。

    文献报告胃癌p53基因的杂合缺失（LOH）率为36.5~73%。Sano等分析48例胃癌的LOH，高分化早期胃癌和晚期胃癌的LOH率分别为67%和73%。低分化癌为60%，提示无论高分化和低分化癌均可出现LOH，p53基因缺失是胃癌晚期的特征，在胃癌由早期向晚期发展过程中，p53基因突变先于LOH，且随肿瘤的进展LOH发生率呈递增趋势。

    Martin等发现57%胃癌可见高水平p53蛋白的表达，p53蛋白在肿瘤细胞核内积聚与p53基因突变之间有明显相关性。对原发性胃癌和胃周淋巴进行免疫组化研究发现，原发胃癌p53蛋白异常表达者为54%，其中有转移者占p53异常表达者的85%，无p53蛋白异常表达的胃癌则只有64%发生 胃周淋巴结转移。McCullcoh等检测英国和日本人胃癌p53蛋白表达，阳性率分别为54%和52%，提示两国患者p53蛋白表达无明显不同。应用流式细胞仪进行DNA染色体核型分析发现，p53蛋白阳性胃癌染色体畸变率为69%，而p53蛋白阴性癌为45%；对胃粘膜细胞动力学进行观察研究发现，具有突变p53蛋白表达的胃癌具有高增殖能力，并且易于发生淋巴结转移；有p53蛋白表达者5年存活率为56%，无表达者为24%，两组五年存活率有明显不同。对早期癌p53蛋白染色结果提示，p53蛋白表达与早期胃癌的浸润进展有关。Joypaul等检测206例胃癌p53表达，阳性率为46%，p53染色阳性与组织学分级、生长类型和淋巴结转移无显著相关 ，但p53阳性胃癌5年存活率（3%）显著低于p53阴性组（16%）。我们采用免疫组化方法对胃癌p53蛋白的表达进行观察，染色阳性率为36.5%，肿瘤大于5cm组，有淋巴结转移和浆膜侵犯及Ⅲ、Ⅳ期胃癌组p53蛋白染色阳性率分别显著高于肿瘤小于5cm，无淋巴结转移和浆膜侵犯及Ⅰ、Ⅱ期胃癌组。p53染色阳性者5年存活率21.1%，阴性者为50.0%，两者5年存活率差别显著。以上结果提示，检测胃癌组织p53蛋白对胃癌病人预后判断有一定价值。

    （2）Rb基因
    Rb基因定位于染色体13q14.2，共有27个外显子和26个内含子，DNA全长200 kb，编码一种由928个氨基酸组成，分子量110000的p110 Rb核内蛋白。Rb蛋白的磷酸化为Rb基因调解细胞生长分化的主要形式。Rb基因的失活方式有缺失、重排和突变等。

    目前有关胃癌Rb基因结构异常报道较少，对13号染色体LOH研究发现，胃癌13号染色LOH率占信息个体11~14%，Constancia等应用Southern blot技术检测Rb基因结构改变，发现胃癌Rb基因LOH率29%，未发现有Rb基因重排。我们采用Southern杂交方法对15例胃癌及癌旁组织进行研究，发现2例胃癌组织有Rb基因的缺失，共中1例伴有Rb基因的重排，说明Rb基因的失活也参与了胃癌的发生发展。

    （3）APC基因
    APC基因最初是在结肠腺瘤性息肉（adenomatous polyposis coli） 病人中发现的，并以此命名。APC基因定位于染色体5q21-22。最初研究表明，该基因由15个外显子和14个内含子组成，分布在大约120kb基因组DNA上，其cDNA长约8538bp，前14个外显子占20kb，而第15外显子长达6.5kb左右。近来发现在该基因5'端到外显了1间还存在4个外显子，这些外显子连同外显子1具有多种拼接种方式，从而产生功能上的差别。蛋白产物分子量311.8kd,含2844个氨基酸。蛋白产物位于细胞质内，其氨基末端区存在由7个氨基酸组成的重复结构，这一特点与中间相互作用。其中心区存在20个氨基酸的重复结构单位，该结构反复出现7次，形成半规律空间构象。多肽链羧基末端区是由200个氨基酸形成的基本结构单位，最近发现APC蛋白可与α-及β-catenin连接，而这两种蛋白是细胞粘附因子-E钙粘蛋白细胞内配体，在细胞粘附中发挥作用。Munemitsu等证实，APC蛋白羧基端双可与细胞微管相联接，因此，APC蛋白可能通过调控catenin与微管间信号传递，对细胞的运动、粘附及细胞内外信息交流产生影响，进而调节细胞的生长和分化。

    通过在胚系（germ line）和体细胞(somatic cell)水平对APC基因检测，发现常见的异常为点突变和缺失，并且2种异常在胚系和体细胞中无显著差别。APC基因异常集中在外显子15的5'端前半部分中，该区域中只占不到1/3的编码区，尤其要体细胞突变中大约有64%的突变发生在密码子1286~1513之间，所以该区域称为“突变密集区”（mutation cluster region）。但并未发现有突变热点（hot spot）。APC基因突变导致正常组织恶变的关键在于APC基因编码蛋白产生改变。正常APC产物中的疏水域能稳定两。螺旋间的相互作用形成一个“环状圈”，使它们结合成同源或异源二聚物，该二聚物能抑制细胞有丝分裂。APC基因异常往往引起APC蛋白“去顶”（trunction）改变，人机消弱了APC蛋白所固有的抑制细胞增殖的功能，导致细胞增殖。

    APC基因失活与胃癌的发生密切相关。Sano等检测48例胃癌组织染色体5q缺失，发现早期和进展期胃癌的缺失率分别为60%和36%。对胃腺瘤研究表明，APC基因突变率为20%，说明同大肠腺瘤癌变的分子机制相似，APC基因突变在胃腺瘤向癌转变碦中可能起重要的作用。Rhya等对52低例胃癌、癌旁不典型增生研究发现，APC/MCC基因LOH只出现在癌肿组织中，而癌旁正常组织未检测到这二种基因LOH。Tamura等先用流式细胞仪分先胃癌细胞，然后检测胃癌细胞APC基因改变，发现胃癌APC的LOH率为86%，APC基因LOH既可见于分化型胃癌，又可见于未分化癌，既可见于早期癌，又可见于晚期癌，其中1例粘膜内癌亦发现有LOH。提示APC基因LOH是胃癌的早期改变，可能在胃癌发生的早期阶段起重要作用。

    从组织起源的角度，胃癌可分为肠型和弥漫型。Sano等研究发现，染色体59的缺失只出现在肠型胃癌，而弥漫型胃癌未发现有5q缺失。Nakastsu报道肠型胃癌afr基因突变率为20%，LOH率41%，显著高于弥漫型胃癌。以上结果提示，弥漫型胃癌与肠型胃癌在发生发展的分子机制上可能存在和演进中起重要作用。但亦有持有不同意见者。Horri等分析44例胃癌，其中3例APC基因突变者均发现弥漫型胃癌。Mckie等也发现肠型胃癌APC基因LOH率为22%，而弥漫型为43%，说明APC基因异常亦参与了弥漫型胃癌的发生与演进。关于APC基因失活与胃癌组织发生学的关系，尚需进一步大综样本分析，并对APC基因全部外显子及内含子突变及缺失情况进行全面分析后，才能得出确切结论。

    （4）MCC基因
    MCC基因亦即结直肠癌突变基因（mutated in colorectal cancer）。该基因同APC基因一样也位于5q21，仅与APC基因相隔150kb，含17个外显子，16个内含子。其cDNA长约4181个核苷酸，蛋白产物分子量为93kd,含929个氨基酸。蛋白中有一段约19个氨基酸区域和与G蛋白相偶联的M3蕈毒素乙酰胆碱受体的序列相似。该受体在G蛋白激活中发挥关键作用。而G蛋白家族在细胞信号传递中起重要作用。MCC蛋白也存在与APC相似的七个氨基酸组成的重复结构。因此很可能两者相互作用结合成有生物活性的复合物。这样任何一个基因失活都足以引起该复合物功能丧失，从而在肿瘤发生发展中起作用。

    有关MCC基因在胃癌中改变的研究报告较少。Tamura等采用细胞分选技术检测异倍体胃癌细胞MCC基因LOH，发现7例信息个体均存在MCC基因LOH，认为MCC基因LOH是胃癌最常见的基因改变之一。多数文献报告MCC基因的LOH总是伴有APC基因的LOH，是胃癌发生的早期改变。我们的研究表明，胃癌组织MCC基因LOH率为31.3%，LOH在早期胃癌和晚期胃癌均可见到，与胃癌的组织学类型无明确关系，提示MCC可能在胃癌的早期发生阶段起作用。

    （5）DCC基因
    DCC基因亦称结直肠癌缺失基因（deleted in colorectal carcinoma），定位于染色体18q21.3，含29个外显子，28个内含子，cDNA长约4341bp。DCC基因蛋白产物分子量180kd，含1447个氨基酸，是位于细胞表面的跨膜磷酸化蛋白质。DCC蛋白由细胞膜内和膜外两部分组成。细胞膜外部分约含1100个氨基酸，氨基酸顺序与神经细胞粘附分子（N-CAM）及其它相关的细胞表面糖蛋白十分相似。DCC蛋白中存在与免疫球蛋白和m型纤维粘连蛋白类似序列。已知CAM及其它细胞表面糖蛋白相似的机制，参与细胞之间，细胞与基质之间的相互作用，使细胞维持正常的分化和生长。DCC基因失活的方式为突变和缺失。如果该基因失活，可导致细胞的生物学行为，如细胞粘附、接触性抑制及运动发生重要改变，使细胞朝恶性化方向演变，并容易发生转移。

    DCC基因在胃癌中的缺失率为40%~60%左右，Uchino等检测28例胃癌12条染色体的LOH，18q的LOH率为61%，并先于17q的LOH。5例早期胃癌中有4例发生18q的LOH，提示DCC基因参与了胃癌的早期发生。然而Ranzani等的研究表明，DCC基因缺失主要出现于中晚期胃癌，并与临床预后相关。本文作者采用PCR-RFLP技术对手术切除胃癌标本DCC基因LOH进行分析，结果表明，DCC基因LOH率为33.3%，LOH率在肠型及弥漫型胃癌中无显著差别，与肿瘤大小、组织学类型、浸润深度和淋巴结转移无明确关系，但在Ⅲ、Ⅳ期胃癌的LOH率显著高于Ⅰ、Ⅱ期组，提示DCC基因LOH是胃癌的晚期改变可能与病人的预后有关。