胃癌表观遗传学研究

    肿瘤的发生是多基因的遗传和表遗传共同起作用的结果，表遗传学(epigenetics)是研究没有DNA序列变化，可遗传的基因表达(活性)的改变．主要涉及DNA甲基化作用的改变和染色质组蛋白的修饰作用、基因印记等，因可引起癌遗传学途径基因的失能与获能，增加基因组不稳定，印记丢失等途径参与肿瘤的发生发展．胃癌是我国最常见的恶性肿瘤．胃癌的表遗传研究对于胃癌的发病机制，细胞免疫与防御，细胞分化以及预防治疗等方面具有十分重要的意义.

    关键词：胃癌；表遗传学；DNA甲基化； 组蛋白修饰；基因组印记滕玥, 戴冬秋. 胃癌表遗传学研究进展. 世界华人消化杂志 2005;13(19):2289-2293

    引言
    肿瘤的发生是多基因的遗传和表遗传共同起作用的结果．人类基因组含有两类遗传学信息，传统意义上的遗传学信息提供了生命所必需的蛋白质模板；而表遗传学信息提供了何时、何地、以何种方式应用这些遗传信息的指令[1]．表遗传学1939年由Waddington首先提出，目前认为表遗传学是研究没有DNA序列变化，可遗传的基因表达(活性)的改变[2]．主要涉及DNA甲基化作用的改变和染色质组蛋白的修饰作用(乙酰化、甲基化、磷酸化)、基因印记等.研究表明肿瘤细胞基因组的异常甲基化，染色质组蛋白的异常修饰及印记基因异常等表遗传学改变同样参与细胞癌变这一过程，并成为肿瘤细胞的一个重要特征．胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，胃癌的表遗传研究对于胃癌的发病机制，细胞免疫与防御，细胞分化以及预防治疗等方面具有十分重要的意义.

    1 DNA甲基化
    1.1 DNA甲基化与肿瘤 DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，包括基因组总体甲基化水平降低和某些基因启动区域发生高甲基化(hypermethylation).导致些现象的原因还不完全清楚.但已发现肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤的形成及发展上起着重要作用.在肿瘤中，低甲基化通常发生在中度和高度重复序列，包括异色质DNA重复序列、散布的逆转录转座子(retrotransposons)和内源性逆转录病毒元件.另外低甲基化也可发生于单一序列，如一些癌基因等.低甲基化可导致染色体的不稳定.癌细胞在整体低甲基化的水平下，一些局部特定区域是高甲基化，而这种特定区域一般是跨越管家基因和肿瘤抑制基因启动子的CpG岛区.现已确认这种CpG岛高甲基化作用在肿瘤的发生发展中起到重要的作用，也是肿瘤发生中基因表达沉默的主要机制，尤其表现在肿瘤抑制基因和错配修复基因.DNA甲基化沉寂DNA修复基因.损伤DNA的及时修复是维护基因组稳定的重要机制，当DNA修复基因缺陷时，必然增加基因组的不稳定性.由于这种高甲基化具有诱导基因编码区突变和使基因失活的能力而利于肿瘤的发展.在一个癌细胞中，可有多种基因同时被异常甲基化.目前已鉴定的易高甲基化的基因包括：参与细胞周期、DNA修复、耐药性形成、分化、凋亡的基因及参与肿瘤转移和血管生成的基因.从理论上讲，一个肿瘤细胞中可有成百上千个CpG岛被异常甲基化，但研究表明并不是这样，每种肿瘤都有其自身一套基因是异常甲基化；因而根据基因甲基化图谱将肿瘤进行分类和分型是有可能的[3].

    1.2 胃癌的DNA甲基化
    1.2.1 p16基因 又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor,MTS)定位于9p21，全长8.5×103(Mr8 500)，有2个内含子和3个外显子组成．其编码的蛋白是一种重要的细胞周期负调空蛋白，通过与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和CDK6结合而抑制蛋白激酶活性，从而抑制细胞的增殖，被认为是最重要的抑癌基因之一．Lee et al[4]最早报道了p16甲基化与胃癌的关系，他们用甲基化敏感性限制性内切酶研究了9个胃癌细胞株，发现两个有甲基化，而且不表达p16mRNA，体外以去甲基化剂5-deoxy azacytidine对胃癌细胞处理后，可见因CpG岛异常甲基化而封闭的基因重新表达．Lee et al[5]同时测定了胃癌患者肿瘤和外周血基因的异常甲基化，p16甲基化的出现率分别为66.7%和51.9%，而正常对照为阴性．结果表明血清中基因异常甲基化能如实的反映肿瘤中基因异常甲基化的情况，可作为胃癌患者的治疗筛选指标．Kang et al[6]对非肿瘤胃黏膜和胃肿瘤进行包括p16基因在内的甲基化情况进行检测，发现其在癌标本出现比肠化生和腺瘤更频繁，而在胃癌和胃癌组织附近的癌前病变中出现高甲基化现象．Shim et al[7]用甲基化特异性PCR研究了88例散发性胃癌，有微卫星不稳定性的胃癌中62%有p16的甲基化．从而发现其与胃癌的微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)有相关性．Kang et al[8]研究表明，p16在慢性胃炎、肠化生、胃腺瘤和胃癌的甲基化频率逐渐升高，分别为2.7%，7%，11.4%和43.8%，反映了癌的演变过程，也证明它是早期事件．动物实验也证明了p16甲基化是老鼠胃癌发生中常见的早期事件，其频率在胃癌演变过程中(正常胃上皮2.7%；慢性萎缩性胃炎16.7%；肠化生37.5%；胃腺瘤64.7%；胃癌82.5%)逐渐升高[9]．以上结果都证明，p16基因CpG岛发生甲基化可导致p16表达缺失，是该基因灭活的重要途径，与胃癌的发生关系密切，而且多发生在胃癌形成早期，频率较高，可成为胃癌的预测指标．同时其在外周血中的检测可能成为胃癌无创性的筛选检测手段.

    1.2.2 hMLH1 hMLH1是一种DNA错配修复基因，它对胃癌的发生同样有抑制作用．胃癌中的MSI很高，但并无DNA错配修复基因发生突变的报道．于是可以推测：可能是其基因发生了甲基化而导致其功能缺陷．Fleisher et al[10]检测了65例胃癌的hMLH1甲基化情况．结果显示，77.8%的MSI H(high microsatel liteinstability，多个微卫星点突变)发生hMLH1基因的甲基化，75%的MSI L(low microsatel liteinstability，仅有一个微卫星点突变)胃癌发生hMLH1甲基化，仅23%的MSI阴性(无微卫星位点突变)发生hMLH1基因甲基化．Kim et al[11]的研究也充分表明，在CIMP H(CpG岛甲基化表型)胃癌的发生中hMLH1是一个高发甲基化的基因之一，该基因通过甲基化而灭活导致肿瘤MSI发生．这些数据表明：hMLH1基因甲基化可导致DNA错配修复功能缺陷，并与胃癌的微卫星MSI密切相关．Leung et al[12]的研究不仅证实hMLH1基因甲基化与胃癌MSI H密切相关，还证实hMLH1蛋白的丢失与浸润性肿瘤的发生密切相关．Nakajima et al[13]还发现随着年龄的增加，hMLH1甲基化的频率显著增加，提示其在老年人胃癌的发生过程起着重要作用．Kang et al[6]研究发现hMLH1甲基化可能包含在早期胃癌发展过程中，如hMLH1甲基化在癌组织中出现频率为42.2%，比肠化生2.1%,腺瘤11.5%更频繁．研究表明，hMLH1在慢性胃炎、肠化生、胃腺瘤和胃癌的甲基化频率逐渐升高，反映了癌的变化过程[8].

    1.2.3 pS2 pS2定位于第21号染色体，含有3个外显子和2个内显子，编码一含有信号肽的84个氨基酸的多肽，成熟后为一60氨基酸的分泌型胞外多肽.pS2曾被认为是胃癌特异的肿瘤抑癌基因，主要分布在胃肠道的黏液分泌细胞中，在胃肠道的黏膜修复中起作用.Fujimoto et al[14]检测了胃癌、腺瘤和非肿瘤性黏膜的pS2启动子的甲基化情况.结果显示：其主要发生在分化好的胃癌和肠化生黏膜中，发生pS2甲基化的胃癌不表达pS2蛋白.因此他们认为,pS2启动子甲基化参与早期胃癌的发生，这也可能成为胃癌早期的检测指标.

    1.2.4 APC APC(adenomatous polyposis coli，APC)最初是在结肠腺瘤性息肉病中发现的.位于5q的APC基因为一个典型的抑癌基因，其蛋白参与修饰转录活化和细胞周期的调节，在多种人类肿瘤中发现其结构异常，这说明APC基因可能涉及广谱人类肿瘤的发生.通过对胃癌APC基因的分析发现[15]：APC基因没有发生突变.用特异化甲基PCR(MSP)对胃癌标本和胃癌细胞株的分析发现：82.5%的原发性胃癌,97.5%胃癌患者的癌旁胃黏膜和10个胃癌细胞株APC启动子1A呈高甲基化，而启动子1B却没有发生甲基化.由于甲基化，在10个细胞株中，外显子1A没有出现APC表达，而外显子1B却出现APC表达.说明APC启动子1A甲基化在胃癌形成的早期就出现，可成为有用的生物标记.有研究表明：APC在慢性胃炎、肠化生、胃腺瘤和胃癌的甲基化频率均较高，在肠化生中达80.7%,可以说明它是胃癌发生的早期事件[8].同时发现其在慢性胃炎的儿童和成人之间，成人APC基因发生甲基化的频率较高.

    1.2.5 DCC DCC(deletedincolorectedcancer，DCC)基因作为1990年代发现的肿瘤抑癌基因，定位于人染色体18q21.3，其编码的蛋白质是跨膜蛋白.DCC蛋白在配体netrin 1(神经生长因子1)缺乏的环境中，具有肿瘤抑制蛋白的功能，可以诱导细胞凋亡，但在该配体存在时，DCC蛋白则具有抗细胞凋亡作用，这说明其可以作为肿瘤转移或者局部浸润性生长的抑制因子，而DCC功能的丧失可以增加配体netrin 1缺乏环境中的细胞生存.Sato et al[16]研究发现，DCC在胃癌中表达减少或缺失，而其基因没有发生突变，对其甲基化状态分析,75%的原发性胃癌和72%相应的癌旁组织中DCC都发生甲基化，提示其甲基化与其表达减少或缺失有显著的相关性.这表明DCC的不表达是由于其甲基化这种基因外表型变化而非基因序列突变所致.同时，癌旁组织中DCC高甲基化也说明DCC甲基化可能发生在胃癌的早期.

    1.2.6 p14INK4a/ARF(CDKN2A) 定位于染色体9p21，编码2个不同的蛋白质，一个为细胞周期依赖性激酶抑制剂p16INK4a(如上述)；另一个产物为其可变读框基因(alter ativereading frame，ARF)编码，产生一个由132个氨基酸组成，Mr1 390的P14蛋白．P14蛋白能稳定和提高细胞p53水平，增强p53在G1 S期和Ｇ2 M期的限制点效应，最终使细胞阻滞于G1期和G2期，因此p14属于肿瘤抑制基因，具有显著的细胞周期负调控作用．目前认为，恶性肿瘤中p14主要由于p14启动子甲基化而失活．Lida et al[17]发现扩散型胃癌p14启动子甲基化率为45.5%.同时，因p14启动子甲基化而失活者，在细胞质中可以发现MDM2(murine doublegene 2)，而且p53表达失活，用去甲基化试剂处理后，MDM2又回到细胞核而且p53也表达．Esteller et al[18]对胃癌细胞株的分析发现，7个细胞株中有5个不表达p14mRNA，对不表达者进一步分析，发现其启动子高甲基化．有研究表明：p14在胃腺瘤和胃癌中的甲基化频率比在胃炎和肠化生中明显升高，且当成人和儿童在患这两类疾病时，前者p14甲基化频率比后者高.

    1.2.7上皮-钙黏素 它是一种重要的钙依赖性黏附分子，在上皮细胞之间起着同质性黏附及维持组织结构完整性的作用，在多种肿瘤中的表达降低或丢失.它在胃癌中的表达与肿瘤的浸润、转移呈负相关.在约50%的未分化型胃癌中，上皮-钙黏素有突变，从而被灭活.Tamura et al[19]的研究显示,上皮-钙黏素基因启动子的甲基化可导致其表达降低，而且发生于胃癌的早期.他们用甲基化特异性PRCSSCP及直接测序PCR产物的方法，来研究上皮钙黏素基因启动子的甲基化情况，该技术可以检测出启动子内所有被甲基化的胞嘧啶.对53例原发性胃癌检测结果显示,51%的胃癌有甲基化，未分化型胃癌的甲基化率(83%)明显高于其他组织类型的胃癌(34%)；早期胃癌与进展期胃癌的甲基化率相似，对4例进展期胃癌和2例早期胃癌的DNA经硫化处理后进行了测序分析，发现这6例胃癌的上皮-钙黏素基因，在靠近转录起始部位的CpG均发生甲基化，经Western印迹杂交检测，证实有4例肿瘤的上皮-钙黏素蛋白表达消失或明显减少.由此可见：上皮-钙黏素基因启动子的甲基化与胃癌密切相关.

    1.2.8 CD44 是一种多功能性跨膜透明质酸受体，在多种细胞、尤其是白细胞表面存在.现发现许多肿瘤表达变异的CD44，且与肿瘤转移密切相关.Sato et al[20]用Northern印迹杂交法检测了8个胃癌细胞株中CD44mRNA表达情况，发现有一个胃癌细胞株不表达CD44；用甲基化敏感性内切酶检测，发现该细胞株有CD44启动子的甲基化；用去甲基化试剂5-azacytidine处理后，该细胞株恢复CD44的表达.至于CD44甲基化在胃癌中的作用，还不是很清楚.

    1.2.9 CDX2基因 Ko et al[21]对109对胃切除标本的半定量RT-PCR研究表明胃腺癌中CDX2有过度表达，CDX2的过度表达与CDH17的过度表达相关.Yuasa et al[22]对胃癌男性和女性患者CDX2甲基化状态的比较研究表明：CDX2的甲基化与过去的生活方式如植物性饮食的摄入有关.这为肿瘤的饮食预防及治疗提供了线索.

    1.2.10 COX-2(环氧合酶-2) COX-2是COX的同工酶之一，定位于1号染色体1q25.2-q25.3,由10个外显子和9个内含子构成.呈诱导性表达，即生理状态下，多数组织不表达.其过度表达与抑制凋亡，促进增殖和肿瘤发生有关，包括消化系统肿瘤在内许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有COX-2基因扩增及其蛋白高表达[23].而近年在某些结肠癌和胃癌中发现COX-2低生成.Yu et al[24]的研究表明COX-2基因CpG岛的高甲基化是胃癌亚群中介导基转录静止的主要机制.Park et al[25]研究表明组蛋白H3乙酰化可上调COX-2表达，组蛋白脱乙酰化在其低生成中起作用.可见DNA甲基化和组蛋白乙酰化对COX-2调节起重要作用.

    1.2.11 RASSF1 RASSFl基因位于染色体3p21，其启动子有A,B,C三种.在多种肿瘤中该基因启动子呈高甲基化状态.Byun et al[26]研究在胃癌细胞株中60%和33%的RASSFIA和RASSFIB未表达，而RASSF1C均表达，在RASSF1A和RASSF1B未表达的细胞株中，发现其启动子均高甲基化，用去甲基化剂处理后，它们都又出现表达.在胃癌标本中，由于甲基化而导致RASSF1A和RASSF1B表达异常或不表达者分别为46%和19%.两者均不表达者为13％.RASSF1A表达异常与肿瘤的分期和分级有关，而与组织学类型无关.RASSF1A表达异常者，其CpG岛甲基化率为95％,但正常组织却没有这一现象.该基因发生甲基化的细胞株和患者RASSF1呈低水平表达或不表达.这说明RASSF1的失活与其启动子甲基化有关，同时说明RASSF1尤其是RASSF1A甲基化在胃癌形成中扮演重要角色.

    此外，近年人们的正在研究和观注的基因甲基化还有SOCS-1,p15INK4b,FEZ1/LZTS1,众多基因.

    2 组蛋白修饰
    2.1 组蛋白及组蛋白修饰概况 核小体是染色质的基本结构单位.长久以来人们都认为核小体只是一种将遗传信息进行高密压缩从而形成染色体结构的形式.人们还发现其功能不局限于此，核小体在基因遗传的几乎各个方面都发挥着重要的决定性作用.核小体是由核心组蛋白八聚体（2个拷贝的H2A,H2B,H3,H4）及缠绕其外周长度为146碱基对的DNA组成.核心组蛋白的N-端尾部暴露在核小体的表面并可发生共价修饰，从而对基因表达发挥调控作用.常见的组蛋白尾部修饰方式有：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等.乙酰化和磷酸化是可逆性修饰，由于目前尚未发现去甲基化的酶，故认为甲基化是不可逆修饰.

    2.2 组蛋白修饰与胃癌关系 目前，组蛋白修饰与胃癌关系的研究尚不深入.主要集中在组蛋白H3和H4的乙酰化修饰方面.Kondo et al[27]的研究表明组蛋白H4 PINX1基因位点的杂合性丢失和PINX1基因5`端非转录区的低乙酰化与胃癌中PINX1基因表达下降相关.Mitani et al[28]发现在胃癌标本中抑癌基因p21(WAF1/CIP1)促进区组蛋白H3呈低乙酰化状态，这种低乙酰化与p21(WAF1/CIP1)表达减少有关.Hamai et al[29]研究表明HLTF的5\'-CpG岛的异常甲基化和组蛋白的去乙酰化与胃癌中HLTF表达下调有关.

    2.3 检测细胞黏附力的主要方法 在外力作用下，活组织和器官不断改变着其结构和力学特性.作为组织和器官的基本单位，细胞通过自身形状、结构、力学特性和功能的变化来对力刺激作出适当的反应.检测细胞力学特性的方法包括两大类.一类是针对单细胞的局部特征，比如细胞探针(cell poking)、局部细胞膜微吸管技术(micropipette aspiration of local cell surface layer)、细胞内包埋或表面黏着外源性磁性颗粒技术、用显微操作器使黏着细胞伸长部分弧度改变技术、声学扫描显微镜以及原子力显微镜(AFM)等[14-16].另一类是针对单细胞的整体特征，目前主要用于血细胞和肌细胞的力学特性研究.比如全细胞微吸管技术(micropipette aspiration of a whole cell)、用微型平皿对测定细胞的伸缩性、用微吸管对测定细胞的黏弹性[16]以及平行板流动腔系统[17].以下简述其中最具有代表性的两种方法.

    综上所述，特定的组蛋白修饰与特定的基因激活或抑制状态相联系，组蛋白修饰在基因调控中发挥了重要作用.但是目前的研究主要集中在H3和H4，对于H2A,H2B以及H1的修饰及其与基因调控的关系知之甚少，这都将是今后的研究方向.

    3 基因组印记(genomicim printing)
    3.1 基因组印记的定义 基因组印记是一种在基因组DNA水平对双亲等位基因特异性的修饰作用.该修饰作用是在胚胎发育早期形成的，它具有不包括DNA序列变化，但影响基因调控以及引起2个等位基因不同表达的特性.是一个基因的特定亲本等位基因或其所在染色体在配子或受精卵中发生的基因外遗传学修饰，即两个亲本等位基因中的一个在含有CpG岛的序列上甲基化，这一序列称为差异甲基化区，它与该等位基因的表达或不表达密切相关；正常基因组印记的维持部分依赖于亲源特异性、而与组织无关的甲基化在细胞世代间的传递.

    3.2 基因组印记与肿瘤 印记基因可通过如下主要途径参与肿瘤的形成：(1)在肿瘤抑制基因(TSG)的两个等位基因中，其中一个已被印记沉寂，另一个仍有正常功能，若随后发生一次杂合性丢失(LOH)等事件，使后者亦沉寂，这样该TSG失能就启动癌变过程；(2)在促生长基因或癌基因的两个等位基因中，一个被印记沉寂，另一个正常表达，若印记的等位基因发生印记丢失(静止的基因被重新活化表达的现象，被称之为lost of imprinting，LOI)，导致双等位基因表达，基因产物成倍增加，这样的过度表达能参与肿瘤的发生；(3)印记控制区是能调节多个印记基因表达的DNA片段，如发生突变可引起一组相关印记基因异常表达而导致癌变.

    3.3 基因组印记与胃癌 IGF2 即类胰岛生长因子-2，具有促生长的作用.一旦变为双等位基因表达，势必造成表达产物量的增加，促成癌细胞的异常生长.同样作为印记基因的H19，在染色体的位置与IGF2比邻.虽然它的基因产物仅仅是RNA，但已经有报道提示了它对细胞生长起抑制作用，且它的失活与癌症的发生有关.在正常人群里，只有母系的等位基因表达，父系的处于静止状态.Wu et al[30]对70例胃癌患者的研究表明印记丢失导致的IGF2过度表达在弥漫型胃癌中起重要作用.

    由于基因组印记在新生命诞生时已经形成，所以很可能是癌前事件，由此很有可能成为癌症早期诊断的指标.这方面仍需要更深入及广泛的研究.另外，在基因组印记的作用机理上，也存在着许多未知.其中DNA甲基化是一种最有可能的调控信号，除此之外，染色质组蛋自的磷酸化、乙酰化及甲基化都有可能对基因组印记的调控起作用.目前相关研究较少.

    总之，肿瘤的发生是多基因的遗传和表遗传共同起作用的结果，人类对肿瘤的表遗传研究有许多现象和机制尚未阐明.胃癌的表遗传研究在胃癌的发病机制，细胞免疫与防御，细胞分化以及预防治疗等方面有着广阔的发展空间，将起非常重要的作用.

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