癌的靶向基因治疗基础

    癌的基因治疗是基因治疗的一个分支,也是其中最为活跃的一个分支.本文简介癌的靶向基因治疗的一些有关基础知识.用免疫学方法研究癌的靶向基因治疗也是癌的基因治疗的一个重要方面,但不在本文讨论的范围之内.本文将依次简介下列内容:
基因治疗的一般原则,细胞的靶向,基因的靶向,病因靶向,分子分类,肿瘤干细胞,肿瘤的逆转,瞻望-个体化治疗.

    一.基因治疗的一般原则 据美国国卫生研究院2000年的定义:基因治疗指采用实验医学干扰手段改变活细胞的遗传物质与疾病作斗争. 用基因治疗进行治疗的疾病主要有人类严重免疫缺陷病,HIV,癌症.

    治疗的途径有ex vivo和in vivo.

    靶向癌基因治疗采用的导入系统主要为病毒型载体.用作基因治疗的病毒可分为两型.

    (一) 复制缺陷型病毒 此时病毒作为载体,运送药物前体 、自杀基因、瘤基因和抑瘤基因等.

    (二)  有病毒基因丢失型(onyx-015,HSV-1),增加治疗基因及启动子修饰型(CV706,腺病毒,编码GM-CSF的重组牛痘病毒).野生型病毒(呼肠孤病毒、疱疹性口腔炎病毒).

    据此运送插入基因载体的又可分为病毒载体和非病毒载体,常用的病毒载体有逆病毒、腺病毒、腺相关病毒等.非病毒载体则有脂质体、脂质体/DNA复合体(lipoplex)、裸DNA等.

    onyx-015曾是一个引人注目的、靶向治疗肿瘤的重组腺病毒.原设计思路是p53基因突变是人类肿瘤中最常见的遗传学改变.腺病毒的E1B 55K可与宿主细胞中野生型p53结合并将其灭活.因此构建了将E1B除去的重组腺病毒.它不再灭活wtp53,只能在p53缺失的细胞中复制,从而可靶向p53突变的细胞,通常即为肿瘤细胞.

    但后来发现onyx-015也能在wt p53细胞中复制,复制效率要低很多,复制速度也慢.由于onyx-015毕竟还能杀死瘤细胞,故仍在进行临床试验.

    腺病毒一类DNA病毒在细胞内复制结果致细胞裂解死亡,故称溶瘤病毒,正常细胞一般不罹患.溶瘤病毒的治疗指数可很高,可达100,000:1,一般化疗的治疗指数为6:1,因此近年来备受关注.例如疱疹性口腔炎病毒.

    呼肠孤病毒在动物试验中业经证实对卵巢和结肠癌有效.目前进入临床试验的溶病毒有onyx-015,CV706,G207,V-GM-CSF,Reo,VSV.

    (二) 细胞靶向

    细胞特异性靶向的基础:

    真核细胞基因的典型结构包括启动子、转录起始位、翻译起始侮位、5''端非翻译区、外显子、翻译经止密码、3''端非翻译区、内含子等.

    真核细胞基因的启动区,例如组织特异性启动子的结构十分复杂.部分反映了真核细胞基因调控的复杂性.

    转录是基因表达的起始阶段.启动子与增强子与基因表达的组织或细胞特异性有密切关系.

    转录因子是与启动子或增强子区结合的蛋白质,可激活或抑制一特定基因的转录.转录因子结构有三个结构域,即DNA结合域、反式激活域和蛋白-蛋白相互作用域.转录因子与启动子中TATA box 及增强子结合以调节RNA聚合酶的作用还需辅激活因子、激活因子和抑制因子的参与.转录因子DNA结构域的一些基序结构也已查明.如锌指、亮氨酸拉链、helix-loop-helix等等.转录因子与基因表达的系一般有四种类型,即组成型、可诱导型、组织或细胞特异型、发育调节型.一些组织或细胞特异型启动子列表如下:

    人们也找到一些选择性在肿瘤组织或细胞内基因表达相对特异的启动子,见表:

    从目前情况来看利用这些天然的启动子组装靶向性、特异性、转录活性很强、能发挥治疗某种肿瘤的基因不能满足临床要求,因而己有设想,综合各种优点人工设计组装或合成符合临床要求的启动区.

    (三)基因靶向

    靶向基因的基础知识:

    根据迄今对肿瘤分子生物学的研究,与肿瘤发病相关的基因主要是两类,即瘤基因和抑瘤基因.

    瘤基因能引起动物和人的肿瘤,能将培养中的正常细胞转化成恶性细胞.由于点突变、基因扩增、或染色体重排致瘤蛋白增多,因此属于获得功能(gain in function).瘤蛋白刺激细胞分裂生长.瘤基因来自细胞的原瘤基因,是正常细胞中原瘤基因的突变、活化型.原瘤基因蛋白刺激正常细胞有序的增殖,瘤蛋白是细胞信息转导因子,刺激肿瘤细胞无序繁殖.

    据Volgstein B认为人结肠癌的发病符合多阶段、多基因的线性模型.涉及多个瘤基因和抑瘤基因的参与.我们用CGH的资料构建肿瘤发生的树模型,认为肿瘤发生和发展是多阶段、多基因、多途径的.

    单基因病的治疗,如ADA,可以针对一个缺陷基因用一个野生型基因取代获得成功,肿瘤的治疗不能采用同样的策略.但最近根据转基因动物身上的研究,对这一看法提出了异议.

    抑瘤基因的情况则有所不同.一些众所周知的抑瘤基因是细胞周期的重要调控者,将它们的野生型
转入瘤细胞后对恶性表型有明显的影响.因此靶向抑瘤基因的基因治疗仍是不断探索的热点.

    (四)病因靶向

    肿瘤的病因主要是化学致癌物,但也有一部分与病毒有关.如肝癌、宫颈癌、鼻咽癌都是我国的常见癌,病因都涉及DNA瘤病毒.近年来报道的RNAi被称为基因组的免疫系统,具有很强的抗病毒作用. RNAi的作用最早在线虫中发现的.将双链DNA注入线虫,用原位杂交检测mRNA(par-1),未注射及注射反义RNA均为阳性,只有阴性对照和注射dsRNA的无mRNA表达.RNAi现象有以下特点:

    干扰因子为dsRNA,不是ssRNA.mRNA和蛋白质的不表达有序列特异性.对外显子而非内含子有效.作用很强,每个细胞只要几个分子就有效.作用且持久,可影响下一代.效果还可跨越细胞屏障(口服,浸泡).这一现象相继在细菌、低等动物和植物中证实,但在哺乳动物细胞中遇到了困难,长链dsRNA启动全局性基因沈默(非特异性,如干扰素反应).这一问题在2001年获得突破,发现短dsRNA(～22nt)能在哺乳动物细胞中诱导RNAi.

    RNAi现象的机制十分复杂,是一种多个酶参与的反应

    RNAi的生物学作用主要在调节基因功能,同时作为基因组的＂免疫系统＂,抗病毒感染、抑制转位子活性、对异常RNA发生反应.应用方面主要也是作为检测基因功能的工具和抗病毒和基因治疗. 因此可作为癌的靶向基因治疗工具.2002年10月才取得惊人的进展.宫颈癌与人乳头瘤病毒咸染有关,乳头瘤病毒的E6和E7蛋白分别与p53和Rb蛋白结合,将它们灭活是宫颈癌主要的发病机制.应用RNAi技术使E6和E7表达沈默就能使体外培养的宫颈癌细胞不增殖和凋亡.

    (五)分子分类

    肿瘤的分类对临床治疗至关重要,目前主要依据病理形态学分类,但病理组织学表现相同的肿瘤,临床病程及对治疗反应可明显不同.

    肿瘤的分类可有两种情况,一是发现新的亚类.二是归入早已明确的类别.分子病理学的研究表明,根据基因表达谱.可将有些肿瘤进一步细分.Golub开创了肿瘤分子分类的先例,根据基因表达谱可明确区分AML和ALL,属于笫二种分类情况.接着Alizadeh 等对弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究.基因表达谱分析表明LDBCL可进一步分为GC B-like和Activated B-like 两个亚型,属于笫一种分类.治疗后两者的五年生存率明显不同.因此肿瘤的分子分类引起了广泛的关注.先后己报道了前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌等等.鼻咽癌最常见为鳞癌三级,也即低分化鳞癌.据我们用基因表达谱初步研究,NPC的低分化鳞癌至少可分为两个亚型,它们的生物学及临床意义正在进一步研究中.

    (六)肿瘤干细胞

    肿瘤起源于干细胞的看法早就存在,现在提出''肿瘤干细胞''的概念,指肿瘤中含有少数细胞具有无限的增殖潜能,驱动肿瘤的形成和生长.正常干细胞是引起细胞转化的突变的靶,而瘤干细胞则驱动肿瘤细胞增殖.干细胞最重要的特征就是自我更新(self-renewal),正常和瘤干细胞都具备这种能力,不同的是正常干细胞自我更新也即细胞分裂增殖和分化是受控制的,增殖和分化维持平衡,处于有序状态;而肿瘤干细胞的自我更新是失控的、无序的.

    目前有关肿瘤干细胞存在的证据主要也是根据它的自我更新能力,实验验证有体外的集落形成试验和体内的脾集落检定.例如小鼠骨髓瘤中只有1%～0.01%的细胞能在软琼酯中形成集落,同样肺癌、卵巢癌或神经母细胞瘤在软琼酯中具集落形成能力的也只有0.1%～0.02%的比例.白血病细胞也只有1～4%的细胞在体内能形成脾集落.据此现在认为少数肿瘤细胞有持久的致瘤能力和形成肿瘤,它们就是肿瘤干细胞.其他瘤细胞只有有限的自我更新能力.肿瘤干细胞对于治疗肿瘤有重大意义.现在的治疗可使瘤体积缩小,主要杀死增殖能力有限的瘤细胞,瘤干细胞未杀死就成为复发的基础,如治疗时能特异性杀死瘤干细胞,即使瘤体积不缩小,待以时日,肿瘤也会消退.

    因此靶向基因治疗或靶向治疗均应指向瘤干细胞.目前尚无好的实用的办法将瘤干细胞与–般瘤细胞或正常干细胞区分.这巳成为一个研究热点.有报道人AML干细胞是CD34＋CD38–细胞,约占AML细胞的0.2%,为此提供了线索.

    (七)肿瘤的逆转

    肿瘤的逆转是某些癌瘤细胞失去恶性表型的过程,研究肿瘤的逆转最终会使我们了解一个癌瘤细胞如何逆转恶性的分子生物学基础,所得结果将有助于人们与癌瘤作斗争.1997年用体细胞核移植成功克隆了Dolly羊,成为生物学发展史上的一个里程碑.这一成就对肿瘤研究有何意义?其实早已报道了用豹蛙肾腺癌细胞核移植至激活的卵母细胞可发育成游泳的蝌蚪,70年代Mintz B等曾用小鼠的畸胎瘤细胞植入囊胚期胚胎的囊腔内,分娩出嵌合体小鼠,虽然这一实验并非严格意义上的核移植,但也多少说明肿瘤细胞可在特定环境下失去恶性表型,逆转成正常表型.瘤细胞是特殊类细胞的体细胞,体细胞是定向分化的细胞,植入去核卵细胞后可重新编程,发育为个体.我们将小鼠B16-F1黑色素瘤细胞核植入去核卵细胞也能进入重新发育,目前可发育到32个细胞期.重新编程开始于植入后0～0.5小时,我们己经对两细胞期的早期胚的基因表达谱进行了系统研究,结果正分析中.这种研究虽离实际应用尚早,但可预期,有朝一日阐明其重新编程机制,特别是分离出有效的胞质因子,就有可能投入应用.

    (八)瞻望-个体化治疗

    人类基因组计划于1991年启动,计划15年完成,2001年提前完成草图,今年2003年定稿,宣告正式提前完成,进入后基因组时代.人类基因组计划完成了30亿bp的测定,发现人类基因组在DNA水平上就有很多变异,最常见也是最重要的是单核苷酸多态性(SNP),平均每1000个bps中就有一个.因此SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关.

    我们曾就7个NPC的相关基因的SNP与NPC易感性的关联分析进行研究,发现两个基因的SNP与NPC的易
感性有一定关联:YH1(G1990398T) G/G OR=3.166,CI(95%)=1.784～5.619; CYP2E1(T499840C) T/T
OR=4.225,CI(95%)=1.873~9.531.

    CYP2E1是P450药物代谢酶的一种,不同基因型对多种药物的反应不一样.由此可见SNP的研究是未来医学个个体化治疗的基础