RNAi技术在药物研究中应用日趋广泛

    在多种生物细胞中，外源或内源性双链RNA(dsRNA)可触发细胞内同源mRNA的特异性降解，从而使该基因表达沉默，这种现象称为RNA干扰(RNAi)。1998年，Fire等在研究反义RNA在线虫中的基因阻断作用时首先发现了RNAi现象，随后证实在果蝇、涡虫、水螅、锥虫、小鼠胚胎细胞及哺乳动物成体细胞中均存在dsRNA介导的RNAi现象。由于RNAi在动植物抵抗外源病毒、生长发育调控方面起着重要作用，而且在功能基因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景，所以近几年在国际上掀起了一股研究RNAi的热潮。2001年和2002年，RNAi技术连续两年被国际权威期刊《科学》（《Science》）评为当年十大科学成就之一，足可见其重要。 

    在基因治疗研究中应用看好 
    癌症RNAi抑制内源基因的作用，为癌症的治疗提供了一个新的工具。PLK1基因与有丝分裂有关，在很多癌症中常常表达增高。国外研究人员使用PLK1RNAi技术观察了不同的癌细胞系的增殖情况。所有的癌细胞在转化了针对PLK1基因的小干扰RNA（siRNA）以后，PLK1mRNA和蛋白水平显著降低。MCF-7细胞的PLK1mRNA下降了70%，蛋白水平下降了95%，细胞增殖降低了66%~99%，凋亡提高了1%~5%到13%~50%不等，所以对于PLK1的siRNA具有抗癌细胞增殖的活性。不仅如此，K-RASRNAi还导致癌细胞致瘤性的丧失。这些结果说明，由病毒介导的siRNA能够用于肿瘤特异性的基因治疗，并逆转癌症的表型，是有价值的治疗癌症的工具。 

    病毒性疾病gag基因编码艾滋病病毒（HIV）的衣壳蛋白，其表达产物gag经蛋白酶切后产生3个病毒的结构蛋白p24、p17、p15。其中，p24蛋白在病毒的脱衣壳和装配过程中起重要作用。有人用p24-siRNA感染能表达CD4的HeLa细胞（HeLa-CD4），两天后发现，病毒蛋白的生成量减少为原来的1/4倍，同时也发现gag-mRNA减少。感染5天后，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测发现，在培养上清液中，p24的浓度为对照组的1/25，这些新的药靶为治疗HIV提供了有力的工具。 

    神经退行性疾病普里昂(Prion)蛋白与宿主编码的蛋白PrPc的异构体异常有关，它引起一种神经再生障碍性疾病。Prnp基因编码PrPc蛋白，如果Prnp基因失活，转基因鼠身体健康，并能够抵抗一些感染，可以存活，所以下调Prnp基因是一个潜在的治疗方法。针对Prnp基因用RNAi可以有效和高度特异性地减少细胞内PrPc蛋白的水平，所以RNAi是一个针对朊病毒疾病的令人瞩目的治疗方法。RNAi还可以通过沉默聚谷氨酸序列，治疗其他神经退行性疾病。 

    血管性疾病将携带有绿色荧光蛋白（GFP）和人类血管内皮因子（hVEGF）cDNAssiRNA的重组病毒，注射到实验鼠的视网膜下。结果显示，携带GFP的重组病毒和GFPsiRNA一起处理鼠，其眼睛GFP水平显著降低；siRNA都能导致缺氧产生的VEGF水平的有效和特异抑制，提示siRNA能够用于血管生长异常或癌症等疾病。VEGF至少存在5个异构体，利用载体介导的RNAi特异地敲除VEGF的异构体，结果显示，大分子量的VEGF异构体被特异地抑制。这个方法为研究不同的VEGF异构体功能提供了新的工具。 

    细胞凋亡激活大部分肿瘤表达死亡受体，可以有效和选择性地治疗肿瘤。其中最有前景的激活死亡受体的配体是TRAIL，它能激活TRAIL-R1和TRAIL-R2，诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织没有作用。但许多肿瘤细胞对TRAIL轻度敏感或不敏感，很多实验认为，细胞FLICE样抑制蛋白(cFLIP)的产生是TRAIL抵抗的主要原因。国外研究人员将cFLIPsiRNA，通过电穿孔导进SV80和KB细胞，抑制cFLIP的表达。结果发现，FLIP-mRNA和FLIP蛋白水平显著下降，使细胞对TRAIL和其他死亡配体诱导的凋亡敏感性增强，说明通过siRNA下调FLIP蛋白能够增强TRAIL对caspase-8的激活。 

    自身免疫性疾病国外有人用siRNA来考察对不同鼠急性肝衰竭模型的治疗效果。他们在腺病毒表达的Fas配体介导的肝衰竭过程中，在不同时间点给鼠注射caspase8siRNA，抑制caspase8基因在肝脏的表达，结果防止了Fas介导的细胞凋亡，保护了肝脏，减弱了Fas抗体或腺病毒表达的Fas配体诱导的急性肝衰竭，鼠的存活率有很大改善，说明siR鄄NA有较大的希望用于患者的急性肝衰竭。用RNAi技术还可直接干扰Fas的表达，达到治疗的目的。还有人通过给小鼠体内血管注射FassiRNA，用RNA酶保护实验测得Fas-mRNA减少为原来的1/8~1/10倍，用蛋白质免疫印迹法测得Fas蛋白减少至与背景一致，并且该效果在10天内没有减弱的迹象，同时用Fas-siRNA处理过的肝细胞对由Fas抗体介导的细胞凋亡和由ConA引起的凋亡产生抗性，提示通过RNAi敲减Fas的表达可作为治疗肝病的一种策略。 

    利用RNAi技术可快速发现药靶 
    RNAi是一种高通量破坏基因功能的方法，因此，在药物发现过程中可以对靶基因进行高通量的功能分析，有助于鉴定药物作用的生化模型和基因编码产物与特异化合物的相互作用，从而使得研究人员在临床前药物开发中，能够更好更快地发现药靶，进一步确定哪一个候选药物能够继续开发下去。 

    例如，在实体瘤和血液瘤中，Ras是最常见的突变致癌基因。K-ras基因在胰腺癌的突变率可达到90%，结直肠癌达到60%；N-Ras基因在慢性骨髓单核细胞白血病和急性骨髓白血病突变分别达到60%和40%。Ras蛋白GTPase活性经突变而丧失后，将不再被GAPs关闭，处在与GTP结合的活性状态，导致癌症表型。利用RNAi技术可以序列特异性地使RasmRNA降解，抑制Ras蛋白的表达，阻断或者逆转Ras蛋白信号功能的异常，为Ras蛋白信号功能异常的癌症治疗提供合理的药物设计。同样，RNAi技术在前列腺癌的抗雄激素治疗中也得到了很好的应用。ARA70以寡聚体的形式与雄激素受体（AR）相互作用，提高AR的转录活性，用RNA干扰抑制ARA70基因的表达，可使ARA70失去与AR的相互作用，中断AR的转录活性，恢复对前列腺癌细胞的抗雄激素治疗的正常功能，这证实ARA70是抗雄激素治疗的抵抗者，可能是治疗AR介导的前列腺癌的一个关键靶点，在前列腺癌的发生中起重要作用。 

    RNAi技术是耐药性研究的有效工具 
    多药耐药基因1（MDR1）的基因产物P-糖蛋白过度表达，会使癌细胞产生多药耐药性。临床上，MDR是化疗治疗癌症失败的主要原因之一。为逆转MDR1基因依赖的多药耐药性，可构建siRNA抑制MDR1的表达。siRNA被用于处理人胰腺癌和胃癌细胞。在这两个细胞系统，siRNA可特异地抑制MDR1mRNA和蛋白91%的表达，对柔红霉素的抵抗分别下降了89%和58%。说明这个方法可以特异地逆转癌症患者P-糖蛋白依赖的多药耐药，增加对药物的敏感性。因而有研究指出，RNAi能够作为调节MDR的一个有效工具。 

    日前，RNAi技术已用于药物研究的各个领域，尤其在药物开发中，能够解决一些瓶颈问题，如药靶鉴定、优化药靶，从而节省时间和资金，提高成功率。同时，RNAi技术在药物研究的其他领域都显示了卓越的作用，为药物研究提供了强大的工具。