肝癌的生物治疗

    肿瘤的生物治疗是建立于现代免疫学和分子生物学基础上，使用生物大分子、基因以及其他天然或化学合成药物，通过调节机体自身内在免疫防御机制达到治疗和预防肿瘤目的一种全新治疗方式。肿瘤生物治疗技术问世以来，得到迅速发展，已成为有别于传统治疗方式的一种极具希望的抗肿瘤治疗手段。

    我国为肝癌高发地区，发病具有明显特征，约90%具有病毒性肝炎背景，肝炎病毒的感染和复制与肝癌的发生和进展明显相关。虽然早期亚临床肝癌手术切除治疗效果较好，但是多数患者就诊时肿瘤已进展至晚期，有效治疗方法不多。肝癌患者中约80%可见AFP阳性，50%患者肝癌组织中P53高表达，60%患者可检测到病毒性肝炎抗原，为肝癌的生物治疗提供了良好的靶向。目前肝癌生物治疗主要集中在基因治疗，免疫治疗。

    一、 基因治疗
    肝癌的发生和发展与癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有关，因此最理想治疗方式为基因治疗，主要包：
    1、 自杀性基因疗法：
    自杀基因又称病毒介导的酶前体药物治疗(VDEPT)，是将药物治疗与基因治疗技术相结合的一种治疗方法。目前用于肝癌基因治疗的自杀基因有：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因/GVC系统、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因/5-FC系统、嘌呤核昔酸磷酸酶(PNP) 基因/氟达拉滨系统等。

    单纯疤疹病毒(HSV)载体携带胸腺嘧啶激酶基因(TK)，进入肝脏肿瘤细胞并表达HSV-TK基因，使丙氧鸟苷三磷酸化，抑制肝癌细胞DNA聚合酶活性，或代替dTP掺入到细胞DNA中，使肝癌细胞蛋白质合成受到抑制，肝癌细胞死亡。此外HSV-TK-GCV系统还可通过旁观者效应杀伤肝癌细胞，不仅转染了HSV-TK基因的肝癌细胞大量死亡，而且周围未经转染的肝癌细胞亦有明显的死亡。HSV-TK-GCV系统还可通过诱导机体免疫反应，使肝癌组织周围CD4+和CD8+T淋巴细胞大量浸润，抑制肝癌细胞增殖。目前实验研究表明HSV-TK-GCV系统抗肝癌作用确切，已进入临床I期试验[1]。

    CD基因编码胞嘧啶脱氨酶可将进入肝癌细胞中的5-氟胞嘧啶（5-FC）转化为5-FU杀死肝癌细胞。Gaveui等[2]经肝被膜下和门静脉注射，用CD基因转染和5-FC治疗鼠肝癌模型，96％的实验动物肝癌体积缩小。CD基因还可通过诱导及增强宿主的免疫系统功能，活化淋巴细胞，促进CD4+和CD8+T淋巴细胞在肿瘤局部浸润，提高机体对肝癌免疫监视和免疫清除功能，抑制肝癌的发生、发展。Krohne等[3]用PNP /氟达拉滨系统转染人肝癌细胞株HepG2和Hep3B，结果HepG2和Hep3B肝癌细胞株死亡。

    近年来在自杀基因系统的基础上，提倡合并使用其他抗肝癌生物治疗方法，如联合使用细胞因子，可促进CTL细胞及NK细胞增殖，细胞毒作用增加。Kim等[4]联合应用CD/5-FC和IL-18转染人肝癌细胞株，结果肝癌周围可见大量CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润，肝肿瘤体积明显缩小，明显优于单用CD/5-FC组或IL-18组。Kwang等[5]将IL-2与HSV-TK基因联合应用于活体治疗肺癌肝转移，结果肝肿瘤完全消退。

    2、免疫调节基因
    肝癌患者存在免功能低下，因此可通过导入相关免疫调节基因，达到提高宿主免疫力和治疗作用。使用最为普遍为细胞因子基因治疗。目前应用于肝癌基因治疗的细胞因子基因有IL-2、IL-12、IFN、TNF和GM-CSF等。根据转染细胞的不同，细胞因子基因治疗可分为2种，一种为将细胞因子基因导入免疫活性细胞，如LAK细胞、树突状细胞等，增强其功能，达到提高抗肿瘤免疫的作用。同时LAK等免疫活性细胞具有向肿瘤灶趋化的功能，可使肿瘤灶细胞因子局部浓度提高，更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫效应。另一种为细胞因子基因导入肝癌细胞，直接造成肿瘤微环境中细胞因子的高表达，吸引多种免疫细胞大量浸润并激活其功能，增强对肝癌细胞的免疫应答，有效激活肿瘤特异性免疫反应。由于转导或未转导基因的肿瘤细胞具有相同的肿瘤抗原，其激发的特异性免疫反应不仅杀伤已导入细胞因子基因的肿瘤细胞，而且对未转导基因的亲代肿瘤细胞产生特异性的杀伤，从而治愈肿瘤[6-9]。

    细胞因子基因治疗的发展趋势是联合基因治疗和组织靶向性表达。联合基因治疗有助于细胞因子间发挥相互协同的生物学作用，提高基因治疗效果。IL-2和IFN-a的联合使用的治疗已经进入II期临床，疗效确切，副作用不大。

    二、 免疫治疗
    1、 单克隆抗体和细胞因子
    八十年代，伴随着分子生物学技术的发展，许多细胞因子的基因被克隆，并且运用基因重组技术在原核或真核细胞中进行表达，使那些在生理条件下难以分离的细胞因子和抗体得以大量生产，特异性免疫治疗。临床上—般多用于肝癌综合治疗，可单独或与免疫活性细胞以及肝癌疫苗联合使用。

    利用肝癌特异性单克隆抗体，将放射性同位素、抗肿瘤药物、免疫毒素等“弹头”与其连接，特异性提高肝癌局部的药物浓度，期望提高治疗效果。目前131I-铁蛋白抗体和131I-抗人肝癌单克隆抗体己用于肝癌临床治疗。有报道：该方法与肝动脉结扎联合应用，能明显缩小肝癌体积，创造手术切除机会，提高和延长肝癌患者生存期。由于McAb具有渗透性差、免疫原性强等缺点，导向作用往往被削弱。随着分子生物学技术的发展，现已研制出基因工程抗体，如抗体的人源化改造、单链抗体等，可望克服上述缺点。

    2、 细胞免疫治疗：
    1） LAK细胞、TIL细胞和CIK细胞淋巴细胞因子激活的杀伤细胞（LAK），为IL-2在体外活化和扩增的淋巴细胞对肿瘤细胞有较强的杀伤活性，杀伤瘤谱较广，而且不损伤正常的淋巴细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞。经IL-2激活后的效应LAK细胞在体内外对多种肿瘤细胞具有很强的溶解放应，通过对LAK细胞活性的观察，可以推测机体肿瘤免疫的状态，同时对指导临床免疫有重要意义[]。临床研究中应用体外活化和扩增的LAK输入病人体内的过继免疫治疗，对黑色素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤等有一定疗效。

    肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL），为采集肿瘤组织间浸润淋巴细胞，体外培养扩增而成。Schonoclonf等[10]作TIL的细胞表型分析，提示大多为成熟的CD3+细胞，其百分比在80％以上，TIL的NK细胞比率均较低，为5％左右，而LAK细胞中的NK细胞比例为10％左右，说明LAK细胞与TIL细胞在抗肿瘤作用中有不同的杀伤机制参与结果。TIL的杀伤效率高于LAK，wallace[11]在体内示踪TIL与LAK细胞时发现，只有当肿瘤部位的活性细胞数达到一定数量后才能显示其治疗效果，TIL回输后主要积聚在肝脏，提示了TIL在肝癌治疗中的进一步应用的有利因素[12]。

    细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokines-induced killer cells)，为使用多种细胞因子IL-2、IL-4、IFN、TNF和GM-CSF等诱导的具有更强杀伤活性的淋巴细胞。CIK细胞是一类非主要组织相容性复合物和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞，其主要效应细胞为CD3+、CD56+T淋巴细胞。由于多种细胞因子之间的协同作用，使激活的杀伤细胞出现更好的增殖及杀伤活性。CIK细胞可应用于肝癌等多种实体瘤的治疗[13-16]。

    2） 树突状细胞
    树突状细胞（Dendritic Cell，DC）是体内专职抗原提呈细胞，20世纪70年代初Stinman和Cohn首次报道[17]。DC在T细胞免疫应答中发挥重要作用[18]，除摄取、加工、呈递特异性抗原外，DC是唯一能刺激初始（Na?ve）T细胞增殖、诱导初次免疫应答的APC，具有启动特异性免疫应答和诱导免疫耐受的双重功能。90年代后，DC体外培养获得成功，使其逐渐成为免疫学和肿瘤生物治疗研究热点。

    研究发现肿瘤患者DC共刺激分子表达低、IL-12分泌低、刺激T细胞增殖能力弱、寿命短，摄取抗原能力也较正常人DC弱。因此，通过调节荷瘤宿主DC功能，从而诱发或增强宿主抗肿瘤免疫反应，成为肿瘤特异性免疫治疗的重要措施。通过修饰改造患者APC，使其携带肿瘤特异性抗原活化初始T细胞，产生特异性抗肿瘤效应的DC疫苗，在动物实验和临床试验中已取到较好的效果[19]。Mule等[20]以黑素瘤细胞溶解物致敏DC免疫患者，产生特异性T细胞应答。黑色素瘤合成肽DC疫苗II期临床试验也已在匹斯堡肿瘤研究所完成[21]。治疗后，28例患者中2例所有检测指标均转阴；1例50%的指标下降，并持续2年。此外，在肾癌[22]、胃肠道肿瘤[23]等的治疗中也取得一定疗效。进一步随机临床试验报告证实用肿瘤细胞裂解物或射线灭活肿瘤细胞进行治疗的肿瘤患者的总生存期和复发生存期均有所改善[24-227]。

    在肝癌患者，回输用肿瘤抗原冲击致敏的树突状细胞观察到了肿瘤的客观缓解，针对肝癌的动物学试验已经证实，AFP致敏的DC疫苗不仅能够抑制肝癌细胞的生长，而且对肝细胞的再生没有影响[28]。Grimm CF等[29]在小鼠肝癌模型应用AFP-DNA疫苗诱导出特异性的CTL，能够抑制肿瘤的生长，并且对正常肝细胞无损伤。

    我们以健康供者外周血单个核细胞（PBSC）为来源，在GM-CSF、TNF-a和IL-4作用下体外诱导培养出具有典型形态特征和表型的DC，诱导的DC光镜和扫描电镜下细胞周围可见毛刺状突起和树枝状突起，透射电镜下细胞表面不规则，可见各级突起，胞内可见溶酶体、线粒体，粗面内质网发达；DC特征性表型CD1a、CD11c表达量分别为47.7%、78.49%，MHC分子HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86表达量分别为66.09%、51.37%、55.83%。

    我们应用肝癌细胞HepG2冻融抗原致敏DC（Hep-DC），与自体淋巴细胞共培养后，进行体外杀伤试验。结果显示Hep-DC-L对HepG2具有较强的杀伤作用，明显高于未致敏DC刺激的淋巴细胞（DC-L）和单纯淋巴细胞（L）（P<0.05），提示HepG2冻融抗原致敏的DC可诱导自体淋巴细胞产生HepG2抗原特异性CTL，对HepG2发挥高效特异的杀伤作用。

    在此基础上，我们应用AFP-cDNA真核表达载体转染DC制备AFP-DC瘤苗，电化学发光法检测培养上清中含有AFP抗原分子，证实AFP-DC能够表达并分泌AFP，同时，细胞免疫荧光染色可见细胞膜及胞浆荧光染色阳性，表明AFP-DC不仅能够表达AFP，并且能够将AFP抗原分子提呈到细胞膜上。AFP-DC活化的CTL对表达AFP的肝癌细胞株HepG2有强的杀伤作用，与对照组相比，差异显著，表明AFP-DC活化的CTL是AFP特异性的。证实肝癌相关性抗原AFP可作为肝癌靶向治疗的突破点，AFP-DC疫苗可以成功诱导出AFP特异性CTL，对表达AFP的肝癌细胞株HepG2具有特异性杀伤效用。

    我们根据原发性HBV感染的肝癌表达病毒抗原HBsAg的特点，以HBsAg作为靶点，采用HBsAg基因脂质体介导转染的未成熟单个核细胞来源的树突状细胞，能够诱导特异性的CTL，能够表达乙型肝炎表面抗原。CTL对表达HBsAg的肝癌细胞HepG2.2.15有较强的杀伤作用，MTT法检测显示细胞毒性作用明显增强（P<0.01)。对于原发性HBV感染肝癌的免疫治疗，DC疫苗有望成为表达HBsAg肝癌的一种免疫治疗手段。

    肿瘤免疫治疗的关键是如何找到肿瘤特异的排斥抗原，近年来外来体（exosome）作为一种崭新的肿瘤抗原的来源，逐渐成为非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。有学者证明肿瘤细胞本身也可以产生外来体，当将这些外来体负载到人树突状细胞的时候，可以诱导出T细胞免疫应答。而且来源于肿瘤细胞的外来体含有共有肿瘤排斥抗原（shared tumor rejected antigen）[30]，极大地延伸了外来体作为肿瘤疫苗的可能性。

    我们采用基因重组技术构建了用乙肝病毒表面抗原“a”位点基因替换CD74分子的CLIP片段基因的真核表达质粒，希望通过恒定链分子的引导肽将该抗原引导到MVB中，从而进入外来体的形成通路，最终将目的抗原负载到外来体。同时我们利用外来体的直径是50~90 nm的物理特性，采用用基于孔径的生物膜分离技术成功地制备了外来体。希望能采用外来体提取肝癌等肿瘤抗原，解决肝癌生物治疗中特异性肿瘤抗原来源困难的问题

    肝癌的生物治疗日新月异，随着现代基础医学的不断进步，新的治疗方法和手段层出不穷，我们相信其治疗效果将会得到极大改善，在临床应用中挽救更多的生命。

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