胰岛素样生长因子ⅡmRNA分析在肝癌诊断中的价值

    甲胎蛋白（AFP）对肝癌(HCC)的诊断存在着较高的假阳性和假阴性。胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因在胎肝和新生儿肝脏中有大量表达,但出生后该基因迅速降低直至关闭,当肝细胞发生癌变时呈胚胎性过量表达IGF-Ⅱ。研究以逆转录巢式聚合酶链反应(RT-巢式PCR)扩增了肝癌组织及外周血中IGF-ⅡmRNA,并观察它在肝癌诊断、转移预测和鉴别中的临床价值。

    1. 资料与方法：
    (1)研究对象: 手术后新鲜肝组织中,分别留取肝癌的癌灶组织、癌灶周围组织及非癌组织各30份(约200mg),除部分作病理学检查外,其余置于-85℃冰箱保存,留作总RNA制备和IGF-Ⅱ基因片段扩增。另从住院患者中选择慢性肝炎患者30例、急性肝炎30例、肝硬化25例、肝癌111例、非肝肿瘤25例(肺癌和胃癌各6例, 食道癌、乳腺癌、结肠癌各3例, 卵巢癌、胰腺癌各2例)及正常人25例作为对照。所有标本于清晨空腹静脉采血5ml，肝素抗凝并及时分离外周血单核细胞,并以放射免疫法检测血AFP浓度。肝癌和肝炎分别按照全国肝癌防治协作组和北京全国肝炎会议制定的标准核实诊断。

    (2)肝组织总RNA制备: 患者外周血(5ml)中单核细胞或肝组织50mg,置于无核糖核酸酶的匀浆器中,加入RNAzol (美国Promega公司)1.0ml匀浆2min,再按快速抽提法制备总RNA,最后加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（10mmol/L, pH 8.0, 含EDTA 10mmol/L）100μl, 取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算出肝组织中总RNA浓度(以每毫克组织中的微克数计)。

    (3)巢式PCR引物设计: 按文献IGF-Ⅱ基因序列自行设计引物, 由中国科学院上海细胞研究所合成。扩增片段位于基因可编码区氨基侧,在核苷酸的第251～586号核苷酸间,其序列在外部引物为IGF-Ⅱ-1和IGF-Ⅱ-2分别为5′-ATGGGAATGCCAATGGGGAAG-3′(nt 251～271)，5′-CTTGCCCACGGGGTATCTGGG-3′(nt 566～586); 内部引物IGF-Ⅱ-3和IGF-Ⅱ-4分别为5′-TGCTGCATTGCTGCTT ACCG-3′(nt 311～330)和5′-AGGTCACAGCTGCGGAA ACA-3′(nt 461～480)。

    (4)RT－巢式PCR扩增方法: 外周血单核细胞或肝组织中RNA 2μg，加入随机引物（100pmol，美国Promega公司产品）和逆转录酶（美国Gibco BRL公司）合成IGF-ⅡcDNA。第一阶段PCR以外部引物（IGF-Ⅱ-1, IGF-Ⅱ-2各40pmol）和cDNA为模板, 在PE480型DNA扩增仪循环30次, 其扩增产物为336bp；第二阶段PCR以第一次产物为模板和内部引物（IGF-Ⅱ-3，IGF-Ⅱ-4各40pmol）,反应循环程序同上。扩增最终PCR产物为170bp。扩增产物经20g/L琼脂糖电泳和溴化乙淀染色,在紫外光照射下与阴性和阳性（肝癌组织）对照及DNA标准物质进行比较，判定外周血中IGF-ⅡmRNA的扩增结果。

    (5)方法的灵敏度分析: 以已知浓度的肝组织RNA作一系列稀释，然后再分别以扩增IGF-Ⅱ基因的RT-巢式PCR法进行分析,以观察研究方法的最低检出灵敏度。

    (6)统计分析: 以配对t检验和χ2检验等处理和分析资料。

    2. 结果：
    (1)IGF-Ⅱ基因扩增方法建立: 以自行设计的RT-巢式PCR法,对人肝癌组织中的IGF-Ⅱ基因片段进行扩增,结果与原设计片段大小一致,PCR终产物为170bp。在肝癌组织和部分癌周组织见扩增区带，肝癌患者外周血可检出图谱清晰的IGF-Ⅱ基因扩增区带，其大小、位置均与肝癌组织IGF-Ⅱ基因区带相同。而正常对照和其它组均未见该区带出现。

    (2)IGF-Ⅱ基因扩增法比较及灵敏度: 对111例HCC外周血单核细胞中RNA,以一阶段RT-PCR和RT-巢式PCR对其mRNA进行扩增分析。前者检出IGF基因阳性率为6.3%(7/111),后者检出阳性率为34.2%(38/111, χ2＝26.78, P<0.01)。取肝癌组织总RNA(5mg/L)标本分别作10-2～10-8倍稀释,经RT-巢式PCR扩增后，在总RNA浓度为5ng/L以上时均可见阳性区带。

    (3)癌组织IGF-Ⅱ基因片段扩增:在自身配对的肝癌、癌周和远癌组织中癌组织总RNA水平明显低于癌周组织和远癌组织。但以巢式PCR分别扩增IGF-Ⅱ基因,其结果表现为癌灶、癌周和远癌组织中阳性率分别为100%、53.3%和0，癌组织中该基因检出率明显高于癌周和远癌组织。

    (4)IGF-Ⅱ基因扩增的临床应用: IGF-Ⅱ基因片段阳性率在肝癌组为34.2%,良性肝病和肝外肿瘤组均未见IGF-Ⅱ片段出现。其中56例肝癌患者中发现AFP基因片段阳性28例(50%)，IGF-Ⅱ阳性19例(33.9%)，二者同时阳性17例(30.4%)，两者总阳性34例(60.7%)。

    (5)IGF-Ⅱ对肝癌诊断与鉴别价值: IGF-Ⅱ mRNA对肝癌的临床分期、是否伴有肝内或肝外转移进行的分组比较见表１。

    (6)IGF-Ⅱ与AFP浓度、肝癌大小的关系: IGF-Ⅱ基因片段在AFP浓度<50ng/ml的17例肝癌患者中出现6例阳性(35.3%), 在94例AFP浓度>50ng/ml肝癌患者中32例(34%)出现阳性, 组间差异无显著性; 在AFP浓度>200ng/ml和<200ng/ml的两组中, 其阳性率分别为34.9%和32%。在111例肝癌中22例瘤体<5cm, 7例(31.8%)IGF-Ⅱ基因片段阳性; 有89例瘤体>5cm, 31例(34.8%)IGF-Ⅱ基因片段阳性, 组间差异无显著性。

    3. 讨论：
    血源性播散是HCC转移的主要方式,但因肝癌细胞在循环血中非常少,用形态学方法在外周血中寻找癌细胞极为困难,分析HCC的基因标志或相关的基因标志有助于肝癌的诊断。IGF-ⅡmRNA主要位于细胞增殖活跃的癌巢边缘，但在小肝癌中已有较高表达。癌灶中的表达高于癌旁组织，可能与IGF-Ⅱ通过自分泌或旁分泌途径与受体结合刺激肝细胞的异常增生和分泌，加速癌前肝细胞的恶性转化，最终导致肝细胞癌变有关。

    本研究显示IGF-ⅡmRNA与HCC严重程度、血液转移密切相关。观察外周血中IGF-ⅡmRNA的变化,有助于选择正确的治疗方案。血清AFP水平仍是诊断HCC的可靠血清学标志物,但其阳性率为50%～70%,存在相当一部分的假阴性和假阳性,以至部分患者难以确定诊断,况且血清AFP值并不能反映HCC患者是否发生转移。本研究结果说明血AFP值水平与外围血IGF-ⅡmRNA阳性率间无明显关系,检测外周血AFP与血IGF-ⅡmRNA具有互补性, 对于HCC血清AFP阴性或低值的部分患者,检测外周血IGF-ⅡmRNA不失为一项有价值的补充诊断方法，具有联合诊断价值，对肝癌的诊断、监测肝癌的远处转移和复发具有一定的临床意义。