基因突变营养不良

1．2．基因突变营养不良1长链RTPCR及测序从患者取新鲜抗凝血1.5~3 mL，按Qiagen产品（RNeasy Mini Kit）说明书提取总RNA. 长链RTPCR按TaKaRa试剂盒（RNA LA PCRTM Kit）说明书进行. 先进行反转录，然后在PE2400型热循环仪上进行PCR反应：94℃变性2 min后，按94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min循环30次. 最后一个循环结束后继续在72℃延伸8 min. 将上述PCR混合物10~20 μL上样于15 g?L-1的琼脂糖凝胶电泳，切下含预期片段（2440 bp）的胶块，利用Qiagen的DNA凝胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction kit）从胶块中回收DNA. 以此DNA为模板，组配4个2次PCR反应：反应体积50 μL，含模板1 ng, 引物各25 pmol, 4种dNTP各0.2 mmol?L-1, Taq酶（BioAsia）2.5 U, MgCl2 1.5 mmol?L-1，分别扩增ALD1, ALD2, ALD3, ALD4，扩增条件统一为：94℃预变性2 min后，按94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s进行10~15个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸9 min. 用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit）直接从PCR混合液中纯化PCR产物. 将纯化的4个片 　　1．2基因突变营养不良方法ALD基因的mRNA长3.7 kb，其中编码区为2238 bp. 本研究合成4对引物［2］，即：PIF和RT1, PⅡF和RT2, PⅢF和RT3, PⅣF和RT4，分4段（自5′端依次为ALD1, ALD2, ALD3, ALD4）对ALD基因编码区进行扩增，预期大小分别是722, 700, 723和646 bp，其中ALD1的3′端和ALD2的5′端部分重叠，ALD2的3′端和ALD3的5′端部分重叠，ALD3的3′端和ALD4的5′端部分重叠. 若以PIF和RT4为引物对扩增ALD基因cDNA， 预期片段大小是2440 bp. 引物委托上海生工（Sangon）生物工程公司合成.
　　1．基因突变营养不良1对象男，7岁，汉族，福建省周宁县人，因进行性视力下降、步态不稳1 a余入院. 检查：神志清楚，对答尚切题，言语含糊，不配合，双眼视力光感，吞咽困难，饮水呛咳. 心、肺、肝、脾未见异常. 脑电图中度异常，体感诱发电位异常. 颅脑MRI示枕顶部蝶形长T1和长T2信号的病灶. 气相色谱查患者血浆24碳饱和脂肪酸（C24∶0）浓度：13.48 mg?L-1, 22碳饱和脂肪酸（C22∶0）浓度：9.05 mg?L-1，两个浓度比（C24∶0/C22∶0）等于1.49(正常范围0.939左右). 患者非近亲婚配所生，另有一妹妹，无家族史. 临床诊断：肾上腺脑白质营养不良（儿童脑型）.