破伤风免疫

破伤风免疫球蛋白的层析纯化及抗体诊断试剂盒的研制作者：侯燕婷专业：生物化工导师：汪群慧学位：硕士单位：北京科技大学分类：O6-332　　　R446.62 主题：破伤风免疫球蛋白 亲和层析 酶联免疫法 层析纯化 抗体

　　　           全文下载内容摘要人破伤风免疫球蛋白临床上主要用于防治破伤风。本文主要进行了人破伤风免疫球蛋白的层析纯化以及破伤风抗体诊断试剂盒的研制。 通过分析人破伤风免疫球蛋白的原料发现特异性免疫球蛋白与普通的免疫球蛋白在结构、分子量、带电性质上相差不大，在疏水性质上有一定的差异。因此对疏水层析进行了考察。最好的疏水层析效果是：采用2.5mol/L氯化钠平衡，1mL/min流速平衡，50mmol/L磷酸钠缓冲溶液洗脱，添加1.5﹪PEG10000，比活提高了50﹪。 通过进一步考察特异性强的分离方法—亲和层析的纯化效果发现，纯化倍数能够达到80左右。纯化条件为：对于5mL层析柱，pH7.0，20mmol/L的磷酸盐缓冲溶液平衡，1mL/min流速平衡，2mL/min流速洗脱，用pH2.0，1mol/L醋酸溶液进行洗脱，收集的纯化样品迅速用pH10.0，1mol/L的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲溶液中和，防止蛋白质剧烈变化而变性。 对破伤风抗体诊断试剂盒进行了开发研制，选用华兰公司提供的破伤风类毒素作为包被原料，经过考察，自行研制的破伤风抗体诊断试剂盒与市场的试剂盒相差不大，所研制的试剂盒具有很强的敏感性和平行性。其制备步骤为：对破伤风类毒素进行了亲和纯化，保证其纯度。选择合适的包被条件进行抗原的包被，又用戊二醛交联制备了酶结合物。综合优化了各个条件，制得了破伤风抗体诊断试剂盒。 进一步考察了ELISA法测定破伤风活性过程中的各种影响因素。通过实验可以确定氯化钠和硫酸铵溶液对免疫球蛋白的活性测定有显著影响，在层析样品的活性检测中必须对其进行缓冲液置换将盐去除才能进行测定。在pH5～9的缓冲溶液中，破伤风免疫球蛋白的ELISA测定值基本一致，变化不大，而当溶液pH≤4和≥10时，由于活性测定值与正常值偏差较大，需要进行缓冲液置换或调节pH后再进行测定。PEG的存在会干扰破伤风免疫球蛋白的ELISA法活性测定，因此必须根据添加PEG的分子量、浓度等确定是否需要进行缓冲液置换，以保证活性测定的准确性。