血友病的基因治疗

　　血友病是一种遗传性出血性疾病，发病原因是由于患者的血液中先天缺乏某种因子，根据缺乏因子的不同分为三种类型：血友病A(缺乏FⅧ，又称血友病甲)、血友病B(缺乏Ⅸ，又称血友病乙)和血友病C(缺乏FXI)。血友病甲和血友病乙均属X性联隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病C较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病。通常所说的血友病是指血友病A。

　　1发病原因——基因与基因突变

　　在所有的血友病家系中，50%-60%为无家族史的散发家系，其原因主要为存在新生突变或体细胞嵌合[川。人类基因突变数据库(thehumangenemuta—tiondatabaSe网站http//www.uwcm.acuLuw~l/mg/hgmdo.hun1)统计表明，血友病A、B基因突变主要有基因重组、点突变、缺失和插入等种类。血友病A，FⅧ基因位于x染色体长臂远端(Xq28)，全长186kb;含26个外显子(占总长的5)和25个内含子(占总长度的95)，cDNA长9kb，其前体编码2351个氨基酸。由该基因编码的FⅧ为单链糖蛋白，含2332个氨基酸，包括两种不同的分子内同源区：A区和C区。氨基酸序列分析表明，FⅧ由3个A区(每区330-~380个氨基酸)、1个B区(980个氨基酸)、2个C区(每区约150个氨基酸)构成。22号内含子是FⅧ基因中最大的内含子，它所包含的FⅧ相关基因A(F8A)与重型血友病的发生有关。

　　血友病B，FⅨ(hFⅨ)基因位于x染色体长臂远端，定位于Xq27.1区带，靠近脆性x位点而远离Ⅷ因子位点，整个基因共有34kb，由8个外显子和7个内含子组成，反转录DNA(cDNA)约2.8kb，其中编码区长.1.4kb。在凝血串激反应中，FⅨ具有重要作用。在遗传过程中，受FⅨ基因编码的影响，在表达过程中，其产物要经过一系列翻译后修饰，包括：门冬氨酸(Ash)残基加唾液酸，维生素K的谷氨酸7一羧基化，和第64残基的门冬氨酸j}羧7基化，其中羧基化为凝血活性所必需。

　　2血友病的基因诊断

　　2.1直接基因诊断采用分子生物学方法(P(，DGGE，SSCP，DNA测序等)直接测定致病基因的缺陷。FⅧ22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，也是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FⅧ22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。

　　2.2间接基因诊断利用致病基因内外的限制性片段长度多态性(RFLP)作为特异分子遗传标志物，通过家系成员问的连锁关系确定血友病基因的遗传情况进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99。RFLP分析的局限性：必须具有先证者的标本;母亲系该多态位点杂合子，联合多个RFLP才可诊断。

　　2.3产前诊断对高危胎儿可在妊9～12周通过绒毛膜活检;妊12～16周进行羊水穿刺诊断;妊18～2O周可在胎儿镜下取脐静脉血诊断。上述方法都存在流产的危险(约0.5～1)，需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术(FACS)测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期、无创性产前诊断的方法。

　　3基因治疗

　　血友病的传统治疗方法为静脉输入纯化的FⅧ，虽然可以有效纠正临床症状，但有感染人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等危险[2]。因此，基因治疗血友病是一种有效的可供选择的治疗手段。.

　　3.1重组FⅧ浓缩物(rFⅧ)通过基因克隆技术表达，1990年通过美国FDA批准，其生物活性，半寿期与血浆FⅧ相似，安全，无病毒污染，钽价格昂贵，也可产生抗体。目前在加拿大与爱尔兰几乎所有血友病患者，美国7O以上重型HA采用rFⅧ治疗。第二代rFⅧ(BDD)：利用蔗糖代替蛋白作为稳定剂，FⅧ无B区，但仍保留其活性，生化特性基本同血浆制品。由于不含其他人类蛋白，无免疫活性，更安全，有效。第三代rFⅧ：利用鼠单抗，不含人和动物蛋白，尚处临床试验阶段。未来若干年内，转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。