糖尿病肾病病理

0101)OD365#Lgprot21#3min21比(0148?0107)OD365Lgprot21#min21,P<0101],这表明糖尿病肾病细胞中存在己糖胺通路的过度活化"讨论长期以来,人对于糖尿病肾病情况下系膜细胞病变特征的研究大多来源于体外实验"有关糖尿病肾病动物模型系膜细胞的相关研究也非常有限"本研究中我们采用了肾小球微分离技术,从2型糖尿病肾病患者肾活检组织中分离出肾小球,进行体外系膜细胞的培养,观察其表型和功能的改变"尽管系膜细胞在体外连续传代培养可能会发生功能变异,但在严格控制所观察细胞代数并设置合理对照的情况下,利用直接来源于2型糖尿病肾病患者的系膜细胞研究其在糖尿病肾病情况下的表型及功能改变,仍不失为一种较接近DN患者体内环境的研究模式"目前,国内外尚无类似报道"肾小球系膜病变是糖尿病肾病最突出的病理改变之一,体外研究发现,高糖和转化生长因子B1刺激能导致系膜细胞肥大和ECM合成增多"但是,体外观察到的上述现象是否能反映出糖尿病肾病体内系膜细胞的改变,始终缺乏有力的证据来加以说明"我们的研究结果发现,2型糖尿病肾病系膜细胞与对照相比,其细胞体积增大!RNA/DNA比值增加,表现出细胞肥大的特性"糖尿病肾病细胞的3H2Tdr掺入量明显高于对照,细胞生长曲线亦显示其倍增时间短于对照,表明糖尿病肾病细胞的增殖和转化较正常加快"采用免疫荧光染色,发现糖#1372#中华医学杂志2001年11月25日第81卷第22期 NatlMedJChina,November25,2001,Vol81,No.22尿病肾病系膜细胞的骨架蛋白A2SMA及ECM成分层粘连蛋白!纤维连接蛋白的染色强度明显高于正常细胞"流式细胞仪的结果进一步证实糖尿病肾病细胞无论细胞表面还是细胞总的纤维连接蛋白表达量均明显高于对照"上述结果表明,糖尿病肾病细胞具有细胞肥大及ECM合成增多的表型改变,该实验结果首次揭示了2型糖尿病肾病患者肾小球系膜细胞功能及表型改变的特征,对于2型糖尿病肾病发病机理的研究具有重要的意义"近年来研究发现,肾脏固有细胞本身的糖代谢可能在糖尿病肾病的发病中起重要的作用"葡萄糖转运蛋白(GLUT)负责细胞对葡萄糖的摄取,是调控细胞内糖摄入及糖代谢的第一道关卡[10]"研究发现,GLUT1是肾小球系膜细胞的主要葡萄糖转运蛋白,其表达与活性可能在糖尿病肾病细胞糖代谢异常中起了重要作用[11]"体外研究发现经GLUT1基因转染的系膜细胞,即使在正常糖浓度下也表现出过度的糖摄入!细胞肥大及细胞外基质增加[12]"免疫组织化学染色发现糖尿病肾病患者肾小球GLUT1的表达明显增加[13]"因此,在糖尿病肾病的发生发展中,GLUT1的功能起了非常重要的作用"我们首先对糖尿病肾病来源系膜细胞的糖摄入进行研究,结果发现其糖摄入率明显高于正常细胞,进一步采用Northern杂交和流式细胞仪观察了GLUT1的表达,结果表明糖尿病肾病细胞GLUT1的mRNA和蛋白质表达量明显高于正常细胞"上述结果表明,糖尿病肾病患者系膜细胞糖摄入的增加可能是系膜病变形成的基础,这为进一步阐明GLUT1在糖尿病肾病发病机理中的作用提供了依据"近年来研究发现,高血糖状态下,细胞内正常糖代谢途径的异常活化也介导了高血糖的某些毒性作用"己糖胺通路是葡萄糖代谢途径之一,可能参与了糖尿病慢性血管并发症和胰岛素抵抗的发生[14]"免疫组织化学的研究发现,人体正常肾小球中GFAT的表达量很低,但在糖尿病肾病患者的肾小球中,GFAT的表达明显增加,主要定位于上皮细胞和系膜细胞[15]"本研究亦发现糖尿病肾病系膜细胞GFAT的活性明显高于正常细胞,表明糖尿病肾病细胞中存在己糖胺通路的过度活化"进一步深入阐明己糖胺通路在DN组织损伤中的作用及其调控机制,无疑具有重要的意义"总之,本研究发现以更加接近体内环境的模式揭示了糖尿病肾病系膜细胞表型及功能改变特点,深化了我们对糖尿病肾病系膜病变形成基础的认识"

　　110)cpm#105cell-1,P<0105]"动力学分析发现糖尿病肾病细胞不仅Vmax高于对照(928nmol#mgprot21#h21比829nmol#mgprot21#h21),而且Km值低于对照(0128mmol/L比0138mmol/L),这表明糖尿病肾病细胞摄糖率的增加不仅是由于GLUT1表达量的增多,而且GLUT1对葡萄糖亲和力亦增加"41系膜细胞GLUT1的表达:Northern杂交的结果表明糖尿病肾病细胞GLUT1的表达量明显高于正常细胞,增加约42%(图4)"采用流式细胞仪对细胞表面GLUT1的表达进行检测,发现糖尿病肾病细胞的荧光强度明显高于对照(图5),提示在mRNA表达增加的基础上,糖尿病肾病细胞GLUT1的表达量亦明显增加"注:DN为糖尿病肾病来源系膜细胞,NC为正常对照系膜细胞图5 糖尿病肾病系膜细胞GLUT1蛋白质的表达51GFAT活性的比较:GFAT催化了己糖胺通路的第一步反应,并且是己糖胺通路的限速酶,GFAT的活性能够反应己糖胺通路的活性"糖尿病肾病细胞GFAT的活性明显高于正常细胞[(1111?
　　fructose262Paminotransferase,GFAT)活性测定:采用比色法测定,其基本原理与具体步骤参见文献[9]"101统计学方法:数据以均数?标准差表示,统计学处理采用非配对t检验,以P<0105为差异显着"结果11系膜细胞表型的改变:采用流式细胞仪检测发现,糖尿病肾病系膜细胞与对照相比,其细胞体积增大(图1),RNA/DNA比值增加(表1),表现出细胞肥大的特性"糖尿病肾病系膜细胞的3H2Tdr掺入量明显高于对照(1898?421比1221?262,P<0105),根据细胞生长曲线计算的DT短于对照(3116h?1184h比3510h?5137h,P<0105),该图1 糖尿病肾病患者系膜细胞体积的变化DN为糖尿病肾病来源系膜细胞,NC为正常对照系膜细胞结果表明糖尿病肾病细胞的增殖加快,具有更高的转化率"此外,与正常对照相比,糖尿病肾病系膜细胞细胞骨架蛋白A2SMA染色荧光强度明显增高,同时显示出粗大的骨架结构(图2)"21细胞外基质的合成:采用免疫荧光染色,发表1 糖尿病肾病患者系膜细胞表型的改变(x?s)组别RNA/DNA比值3H2Tdr掺入值(cpm)细胞倍增时间(h)糖尿病肾病0129?01051898?4213116?1184正常对照 0117?01031221?2623510?5137P值<0.01<0.02<0.05图2 糖尿病肾病系膜细胞与细胞外基质免疫荧光染色,A!C及E为糖尿病肾病来源系膜细胞,图B!D及F为正常对照系膜细胞 @400#1371#中华医学杂志2001年11月25日第81卷第22期 NatlMedJChina,November25,2001,Vol81,No.22现糖尿病肾病系膜细胞的ECM成分层粘连蛋白!FN的染色强度明显高于正常细胞(图2)"流式细胞仪的结果进一步证实,糖尿病肾病细胞系膜表面和细胞总的FN表达量分别为对照细胞的117倍和112倍(图3),上述结果表明糖尿病肾病细胞的ECM成分合成较正常细胞增多"注:DN为糖尿病肾病来源系膜细胞,NC为正常对照系膜细胞"峰1为未破膜处理对照,2为破膜处理对照,3为未破膜处理,4为破膜处理图3 流式细胞仪检测系膜细胞FN的合成注:DN为糖尿病肾病来源系膜细胞NC为正常对照系膜细胞图4 糖尿病肾病系膜细胞GLUT1mRNA的表达31葡萄糖摄入率及摄糖动力学的比较:采用葡萄糖非代谢的类似物22DG进行细胞糖摄入测定,结果发现,糖尿病肾病细胞的22DG摄入率明显高于正常细胞[(1592?160)cpm#105cell-1比(1275?
　　细胞外基质(ECM)产生增多和肾小球硬化[1]"肾小球系膜病变是糖尿病肾病最突出的病理改变之一"体外研究发现,高糖和转化生长因子B1刺激能导致系膜细胞肥大和ECM合成增多[2]"但始终缺乏有力的证据来加以说明"况且目前用于糖尿病肾病研究的模型大都采用STZ诱导的1型糖尿病肾病模型,对于2型糖尿病肾病系膜细胞表型改变的认识就更加有限"因此,本研究中我们首次采用了肾小球微分离技术,从2型糖尿病肾病患者肾活检组织中分离出肾小球,进行体外系膜细胞的培养,观察其功能和表型的改变"材料与方法一!材料1.系膜细胞的培养和鉴定:临床期2型糖尿病肾病患者,在行肾活检病理诊断的同时,留取少量肾活检标本,用011%的型胶原酶(美国Sigma公司)37e消化20min后,用微分离方法获得肾小球,置于预先用纤维连接蛋白包被的24孔板中,用含20%小牛血清(FCS,杭州四季青生物工程研究所)的DMEM培养液(美国Promega公司)进行培养,2~3d后可见卵圆型的上皮细胞长出,以后上皮细胞逐渐死亡,代之以梭形或星形的系膜细胞,3周后铺满板底"用0125%胰蛋白酶消化,传代培养"间接免疫荧光鉴定,抗结蛋白!A2肌动蛋白染色阳性,抗角蛋白!因子染色阴性,证实为系膜细胞"对照系膜细胞来源于和糖尿病肾病患者年龄!性别相匹配的正常肾移植供肾,两者间的功能比较控制在相同的细胞代数进行,实验采用第5~10代培养细胞"21细胞大小!RNA/DNA比值的测定[3]:胰酶消化,收集细胞,用含015%苯磺酸(BSA)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次,调节细胞浓度至106个/ml"取上述细胞悬液015ml,用COULTEREPICSXL流式细胞仪进行检测,以前向角散射光(forwardscatter,FSC)的平均强度来反映细胞的大小"另取上述细胞悬液1ml,用10mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(含0188%氯化钠,011%叠氮钠,4%胎牛血清)洗涤两次,离心弃上清,每管加入1ml磷酸盐枸橼酸缓冲液[含0115mol/L氯化钠,5mol/L依地酸(EDTA),015%牛血清白蛋白,0102%皂素,pH值610]室温避光孵育30min后,加入2515Ll72氨基2放线菌素D(72AAD,1g/L,SIGMA)对DNA进行染色,室温避光30min,同上洗3次,重新悬浮,冰浴10min后加入5Ll派若宁Y(PY,100Lmol/L,SIGMA)对RNA进行染色,再冰浴孵育10min,同上洗两次后用流式细胞仪检测,计算RNA与DNA平均荧光强度的比值1每例样品测定5000个细胞"31细胞倍增时间(DT)的测定:系膜细胞以4@104/孔接种于24孔板,待细胞贴壁后用无血清DMEM静止24h,换成含20%FCS的DMEM继续培养,每天更换培养液并进行细胞计数"根据细胞的生长曲线,确定对数生长期的范围,按下述公式计算DT"DT=(t-t1)log2/(logN-logN1)"t为开始进行计数的天数,t1为指数生长期结束的天数,N1和N2为各时间点的细胞数[4]"413H2胸腺嘧啶(3H2Tdr)掺入的测定:系膜细胞以每孔2@103细胞接种96孔板,待3h细胞贴壁后换为无血清的DMEM静置24h,然后换成1%小牛血清的DMEM继续培养48h,最后6h每孔加入37GBq的3H2Tdr孵育,收集细胞,Beckmen液闪仪计数"51免疫荧光染色:每孔2@104系膜细胞接种至纤维连接蛋白(FN)预先包被的ChamberSlides培养过夜,PBS洗3次"用2%多聚甲醛固定"正常山羊血清处理后分别加入A2平滑肌肌动蛋白(A2SMA)!层粘连蛋白(laminin)!纤维连接蛋白(FN)多克隆抗体,室温孵育30min,PBS洗涤3次,加FITC2猪抗兔IgG,室温孵育30min,PBS洗涤3次,荧光显微镜下观察结果[5]"上述抗体均购自DAKO公司"61流式细胞仪检测纤维连接蛋白(FN)!葡萄糖转运蛋白1(GLUT1):用Versene(含0102%EDTA的PBS)消化,收集洗涤细胞"调节细胞浓度至106个/ml,离心去上清,加入1%多聚甲醛室温固定15min,用PBS洗两次"取出一半细胞加200Ll的011%皂素室温作用15min,进行破膜处理,离心去上清,加入FN多克隆抗体(GIBCO),4e作用30min,PBS洗涤两次,加FITC2猪抗兔IgG(DARKO),4e避光作用30min,PBS洗涤两次后,用流式细胞仪进行分析,以平均荧光强度(meanfluorescenceindex,MFI)表示FN的含量"破膜处理后的MFI反应细胞表面和细胞胞浆总的FN含量,而未用皂素处理的MFI反应细胞表面的FN含量[6]"另取1ml细胞悬液,不用皂素处理,加入GLUTl多克隆抗体(CALBIOCHEM)按照上述步骤对系膜细胞表面GLUT1进行染色,同样以MFI的强度反应系膜细胞表面GLUT1的含量,阴性对照为正常兔血清代替第一抗体,每例样品测定5000个细胞"71系膜细胞葡萄糖摄入测定:系膜细胞以每孔5@104细胞接种24孔板,培养至80%融合后,弃培养液,换成20mmol/LHEPES(140mmol/LNaCl,lmmol/LCaC12,5mmol/LKCl,215mmol/LMgSO4,20mmol/LHEPES,011%BSA,pH714)孵育30min后,每孔加入015ml含37GBq/ml的22脱氧2[3H]2D2葡萄糖(22DG,Amersham)的HEPES液,37e孵育15min"HEPES液冲洗3次,加入1mol/LNaOH裂解细胞,盐酸中和,Beckmen液闪仪计数"另留3个复孔进行蛋白测定以作校正"此外,为测定系膜细胞葡萄糖摄入的动力学关系,在lml含37GBq/ml的22DG的HEPES液中,加入非标记的22DG,浓度依此为0125!0133!015!1!5!10mmol/L,按上述方法测定系膜细胞葡萄糖摄入[7]"本实验的结果均重复3次以上"81Northern杂交:待系膜细胞80%融合后,Trizol法提取总RNA,具体步骤参见文献[8]"以看家基因GAPDH的表达作为内参照,人的GLUT1cDNA由美国华盛顿大学Mueckler博士惠赠,探针标记采用随机引物法,标记试剂盒购自美国Promega公司"91谷氨酰胺:62磷酸果糖转氨酶(glutamine:

　　糖尿病肾病的基本病理改变包括肾小球肥大!
　　(4)血管损害,糖尿病肾病病理：所有肾动脉硬化，特别是入球和出球小动脉壁均匀玻璃样变性，肾动脉及其主要分枝动脉粥样硬化。

　　(3)肾小管—间质损害,糖尿病肾病病理：肾小管上皮细胞可见颗粒样和空泡样变性，晚期小管萎缩，基底膜增厚。
　　(2)糖尿病性肾小球硬化症,糖尿病肾病病理：其基本病变为肾小球基底膜增厚和系膜基质增生，其特征性病变是结节型肾小球硬化，也可表现为弥漫型肾小球硬化症及肾小球渗出性损害。

　　(1) 肾脏体积,糖尿病肾病病理：糖尿病肾病早期肾体积增大20%-40%，除伴肾小球滤过率增高外，无任何其他结构改变和临床症征。这种早期的肾体积增大和滤过率增高，可随糖尿病治疗的好转而恢复正常。终未期糖尿病肾病的肾脏大多为纤维增生和缩小，但表面光滑，缩小的程度轻于同样肾功能的肾小球肾炎。