融合蛋白

脑源性神经营养因子(brainderivedneuotrophicfactor，BDNF)是1982年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一。BDNF在中枢神经系统发育过程中，对神经元的生存、分化、生长起重要作用，同时又维持着神经系统的生存和功能，并促进损伤后神经元的再生。当脑缺血后，机体在没有外来因素干预下，内源性BDNF可通过自身代偿调节，提高神经元抵抗缺血的能力，促进受损神经元的修复、再生，调节神经结构的重建，促进脑损伤后认知功能的恢复。但机体自身的代偿能力有限，持续时间较短，随着脑缺血时间的延长，内源性BDNF表达逐渐降低，由于神经细胞损伤后的修复过程及其后的生长必须经历较长时间，内源性BDNF及其受体酪氨酸激酶受体(trkB)的上调尚不足以防治脑缺血性损伤及其以后的细胞死亡。大量实验表明外源性BDNF具有同样的功能活性。应用外源性BDNF给药到达大脑发挥生物学功能将是治疗缺血性脑损伤的一个很有潜力的治疗方法。然而由于血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)的存在，限制了大分子物质在血液和脑组织之间的自由交换，许多有治疗作用的化学药物、多肽和蛋白质包括BDNF及核酸类分子难以透过血脑屏障。目前，国内外还没有能靶向中枢神经系统的生物大分子药物制剂。在动物实验研究中，可用局部注射给药或脑靶向免疫脂质体等方法将BDNF等生物大分子带过血脑屏障并发挥其生物功能。蛋白转导域(Proteintransductiondomain,PTD)是一类可使生物大分子穿过细胞膜进入胞浆内发挥功能作用的寡肽。将PTD与蛋白质、多肽或DNA等分子共价连接后，PTD可将这些分子以一种不依赖受体和膜转运蛋白(transporter)的方式导入细胞。来源于HIV的TatPTD就是一种转导能力很强的蛋白转导域(本研究中简称TAT)。实验证明TatPTD介导的蛋白可以导入近乎所有的细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障，其转导过程不需要能量。因此，TAT蛋白转导系统被认为是一种很有前途的运载工具，无论对于基础研究还是临床治疗，都有着非常广泛的应用前景。为了探索应用TAT将脑源性神经营养因子带过血脑屏障到达脑实质而发挥其生物效能的可行性，本研究中利用PCR方法将编码TAT转导域的cDNA连接到编码成熟BDNF蛋白cDNA的3’端，亚克隆该DNA片段于原核表达载体pET-30a(+)，得到pET-BDNF-TAT表达质粒，并进行了酶切和DNA测序鉴定。为了进行对比研究和得到不含载体序列的表达蛋白，在本课题中还构建了pET-proBDNF-TAT，pET-BDNF和pET-BDNFTAT。其中pET-BDNF-TAT和pET-BDNF被转化进大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达后用亲和层析的方法纯化得到了表达蛋白。表达产物用SDS-PAGE及Westernblot方法进行了分析鉴定。目的：1.构建能表达脑源性神经营养因子(BDNF)-TAT、不含TAT的成熟区BDNF，前体proBDNF-TAT，及不含载体序列BDNFTAT等蛋白的表达质粒。2.表达及纯化BDNF-TAT融合蛋白及对照BDNF蛋白。3.对纯化得到的蛋白进行鉴定。方法：1.根据Genbank中成熟区BDNF和TAT基因序列，分别设计克隆编码BDNF-TAT，BDNF，proBDNF-TAT,BDNFTAT蛋白的cDNA引物，以全长人BDNFcDNA为模板，PCR得到目的基因片段；2.PCR产物与大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)载体分别双酶切后，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌BL21，耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆，在宿主菌中扩增并提取重组质粒，采用限制性内切酶酶谱和DNA测序两种方法分析鉴定；3.将重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)LysS中，用IPTG诱导表达，得到的包涵体蛋白用8M尿素(pH8.0)裂解液裂解，在变性条件下，用超声波破碎细胞，高速离心取上清液后，以Ni-NTA-agarose进行梯度洗脱纯化和PD-10脱盐柱进行浓缩脱盐，得到所需纯化的目的蛋白；4.对纯化得到的重组蛋白用考马斯亮蓝染色，抗His-tag和抗BDNF抗体的Westernblotting进行鉴定，定量后冷冻干燥并低温保存。结果：1.经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA测序证实，本研究构建的大肠杆菌表达质粒有：pET-BDNF-TAT，pET-BDNF，pET-proBDNF-TAT，pET-BDNFTAT。2.经Ni-NTA-agarose亲和层析，纯化得到了BDNF-TAT融合蛋白和基因重组BDNF蛋白。3.BDNF-TAT融合蛋白的分子量约为22kD，基因重组BDNF蛋白的分子量约为18kD。Westernblotting证实所纯化蛋白为构建表达的目的蛋白。结论：1.本课题成功构建了能表达BDNF-TAT融合蛋白、基因重组BDNF蛋白的大肠杆菌表达载体；2.BDNF-TAT融合蛋白和基因重组BDNF蛋白在大肠杆菌中获得了表达纯化和鉴定；BDNF-TAT融合蛋白有可能经血管途径给药后通过血脑屏障进入中枢神经系统发挥神经营养功能。