结核杆菌检测

（三）动物试验常用豚鼠或地鼠鉴别凝似结核杆菌的分离培养物和毒力测定。取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3～4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检：若观察6～8周后，仍未见发病者，也要剖检。剖检时应注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。 　　二)分离培养结核杆菌生长缓慢，培养期长结核杆菌检测，当以酸碱中和浓缩集菌的沉淀物，接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。根据生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色象菜花状，菌体染色抗酸性强，多数为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型，则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。
　　无菌直接采取的脑脊液、导尿或中段尿可直接用离心沉淀集菌。咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂功菌多，需用4%NaOH或3%HCL或6%H2SO4处理，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。
　　一)直接涂片染色咯痰可直接涂片。用萋～纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，因标本中可能混杂有非致病性抗性抗酸杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。如标本中结核杆菌量少，杂菌和杂质多时，直接涂片不易检出（一般需要每毫升痰液含有结核杆菌10万个以上才能检出），应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。
　　四、微生物诊断根据结核菌感染的类型，应采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。
　　结核菌素试验一般使用旧结核菌素（Old-tubercein简称OT），是结核杆菌在肉汽中培养物经加热浓缩的滤液。主要成分是结核蛋白，也含有结核杆菌的其他代谢和培养基成分。稀释1万倍，0.1毫升内含有1个单位（稀释1000倍，0.1ml 有10个单位），取OT结核蛋白纯化后称为精制纯蛋白衍生物(Purified protein derivative ,简称PPD )，取结核杆菌检测作为一个结核菌素单位，是现今国际制造的标准PPD，称为PPD-S。试验法常规使用5个单位OT或PPD-注入受试者前臂掌侧皮内，48～72小时内出现红肿硬节直径大于5毫米者为阳性，虽有红肿但无硬结或硬结直径不到5毫米者为阴性。应注意受拭者处于原发感染早期，变态反应尚未发生，或正患严重的结核病如全身粟粒性结核和结核性脑膜炎时机无反应能力，或患其他严重疾病（麻疹、结节病、恶性肿瘤），如用过免疫抑制剂时，结核菌素反应均可转为阴性。
　　本试验用于测定机体对结核杆菌有无变态反应。将一定是结核菌素注入皮内，如受试者曾感染结核杆菌，则在注射部位出现迟发型变态反应炎症，是为阳性，未感染结核杆菌则为阴性。此法可用检测可凝病人曾否感染结核菌，接种卡介苗后是否阳转以及检则机体细胞免疫功能。
　　结核杆菌检测近年来，实验研究证明结核杆菌细胞免疫与迟发型变态反应是由不同的T淋巴细胞亚群介导和不同的淋巴因子承担的，是独立存在的两种反应。①从小鼠实验表明，结核杆菌感染的细胞免疫应答为Lytl+-2和Lytl--2T淋巴细胞，而迟发型变态反应则为Lytl+2T淋巴细胞。②取结核杆菌rRNA免疫小鼠的T淋巴细胞与rRNA共育的上清中不含巨噬细胞移动抑制结核杆菌繁殖抑制因子（Myco IF）；但用结核杆菌减毒活菌标（H37RV）免疫小鼠的T淋巴细胞与PPD共育，其上清中则含有MIF，而与H37RV共育的上清液不仅含有MIF而且含有Myco IF。这两种免疫小鼠都用结核杆菌强毒株攻击，他们都获得相等程度的免疫力，故认为抗结核细胞免疫是由Myco IF承担，而与MIF无关。
　　（二）免疫与变态反应的关系在结核杆菌感染时，细胞免疫与迟发型变态反应同时存在，此可用郭霍氏现结核杆菌检测说明，①在健康豚鼠皮下首次注射一定量结核杆菌，10～14天后注射部位缓慢地出现溃疡，深而不易愈合，邻近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，此时结核菌素测试为限性。②用相同等量的结核杆菌注入曾感染已康复的豚鼠皮下，在1～2天内即迅速发生溃疡，但溃疡浅而易愈合，邻近淋巴结不肿大，细菌也很少扩散，结核菌素测试为阳性。③在康复的豚鼠皮下注射大量结核杆菌，则引起注射局部及全身严重的迟发型变态反应，甚至导致动物死亡。上述三种现象表明，首次感染出现的炎症反应偏重于免疫预防，溃疡浅而愈合，细菌不扩散，说明机体尚未建立起抗结核免疫力；再次感染发生的炎症发应则偏重于免疫预防，溃疡当浅而愈合，细菌不扩散，说明机体对结核杆菌已具有一定的细胞免疫力，而溃疡迅速形成，则说明在产生免疫的同时有迟发型变态反应，表现出对机体有利的一面；用过量的结核杆菌进行再次感染，则引起剧烈的迟发型变态反应，说明迟发型变态反应对机体不利的一面。人类的原发性肺炎结核，继发性肺结核，严重而恶化的肺结核，相当于郭霍氏现象的三种情况。
　　抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至销毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。
　　（一）免疫性人类对结核杆菌的感染率很高，但发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力。抗结核免疫力的持久性，依赖于结核杆菌在机体内的存活，一旦体内结核杆菌消亡，抗结核免疫力也随之消失，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫（Infection immunify）。
　　三、免疫与变态反应结核杆菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素可诱发机体产生由T淋巴细胞介导的两种免疫应答反应，即细胞免疫和迟发型变态反应。
　　（二）继发感染继发感染也称原发后感染，多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。继发性感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。
　　（一）原发感染是首次感染结核杆菌，多见于儿童结核杆菌检测随同飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡，被巨噬细胞吞噬后，由于细菌胞壁的碳酸脑苷脂抑制吞噬体与溶酶体结合，不能发挥杀菌溶菌作用，致使结核杆菌在细胞内大量生长繁殖，最终导致细胞死亡崩解，释放出的结核杆菌或在细胞外繁殖侵害，或被另一巨噬细胞吞噬再重复上述过程，如此反复引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。原发灶内的结核杆菌可经淋巴管扩散在肺门淋巴结，引起淋巴管炎和淋巴结肿大，X线胸片显示哑铃状阴影，称为原发综合征。随着机体抗结核免疫力的建立，原发灶大多可纤维给的钙化而自愈。但原发灶内可长期潜伏少量结核杆菌，不断刺激机体强化已建立起的抗结核免疫力，也可作为以后内源性感染的来源。只有极少数免疫力低下者，结核杆菌可经淋巴、血流扩散至全身，导致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。