抗体的人源化技术进展

    单克隆抗体在世界医药市场异军突起，已成为世界生物工程制药业的支柱产品之一。随着日渐增多的新型单抗治疗剂进入市场，单抗的第二轮开发也正在成为国际生物医药领域的热点，预计今后几年单抗将发展成为一大类独立医药产品。未来，鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代，其主要原因是：鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；它与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱；鼠源抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC与CDC作用的时间较短；鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。

    1．鼠抗体人源化的构建方法
    鼠抗体的人源化改造主要方法包括嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体。
    嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA。

    表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。

    重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。

    2．全人源化抗体
    完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。

    2.1 抗体库筛选技术
    抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。
    噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL 基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

    核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如，去掉3′末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA 三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)， PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。

    2.2 基因工程小鼠制备全人抗体
    制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。

    Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人源抗体。

    转基因小鼠：将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处：(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；(3)转基因小鼠表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。

    转染色体小鼠：通过微细胞介导法（MMCT方法）将人14号染色体上产生IgH 的胚系片段和2号染色体上5～50 Mb 的κ轻链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后，可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但是，转染色体小鼠导入的人Ig 片断虽然比较大，但其表达的人Ig量却比较低。

    2.3 转染色体牛
    产生人Ig 转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig 轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步发育成转染色体牛。产生人Ig 转染色体牛的构建特点在于：(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系， 因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞；(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC 的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过2次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。