胃癌的基因诊断及PCR在胃癌诊断中的价值

    胃癌的基因诊断及PCR在胃癌诊断中的价值
    随着胃癌发病机理研究的深入，已发现多种基因染色体异常，包括突变、扩增、过度表达及缺失，这些基因的改变决定着胃癌的生物学和临床行为。在胃癌的发生、发展过程中伴有多种癌基因的变化，它们出现的时间不同，意义也不同，多基因异常改变的检测对于胃癌早期诊断、鉴别诊断和恶性程度的判断具有重要意义。

    1、与早期胃癌相关的基因
    ①APC基因(adenometous polyposis coli gene，APC基因)以缺失为主，可引起基因产物的截短或氨基酸改变。这种截短的APC蛋白可与野生型APC蛋白结合并对其产生显性负效应，从而消弱其抑制细胞增殖的功能。Powel SM等认为，APC基因的LOH(杂合性缺失)发生率为20-86%，且多见于胃癌早期。Horri等检测44例胃癌病例，发现3例有APC基因突变，均为组织学未分化型(印戒细胞癌)，而不见于分化型肠型胃癌。因此，检测APC基因有无异常改变，对未分化型胃癌的早期诊断具有一定意义。

    ②P53基因以突变、异常高表达方式参予胃癌的发生发展，而且P53基因突变不仅可见于早期胃癌，甚至在发育不良、肠化生及腺瘤中也可检测到。而且P53在早期胃癌及邻近癌前期粘膜中呈异常表达，而且P53异常表达率从粘膜发育不良®早期胃癌®晚期胃癌中依次增高，支持胃癌发生发展与P53异常有关。因此，检测P53有无突变及异常表达对早期胃癌诊断具有一定意义。

    ③EGF家族的cripto基因在44%的早期胃癌中存在过表达。因此，检测cripto基因在胃癌组织中有无表达异常对早期胃癌诊断具有一定意义。④P16基因在原发性肿瘤中虽然检不出突变，但存在不表达，这可能与P16基因甲基化使保留的等位基因不能转录有关。检测P16有无缺失表达对胃癌早期诊断具有一定意义

    2、与中晚期胃癌相关的基因
    ①ras基因在晚期胃癌中异常表达率高于早期，在肠型胃癌中表达率高于弥漫性胃癌。因此，检测ras基因异常表达对诊断中晚期胃癌具有一定的意义。

    ②C-erbB-2基因阳性表达不仅见于癌细胞，而且癌旁粘膜包括肠化、异型增生和正常胃粘膜上皮均有阳性反应。因此认为C-erbB-2表达出现于胃粘膜癌变过程的后期，是胃粘膜细胞恶性变的标志，进行C-erbB-2表达的检测有助于胃癌病变的鉴别诊断。

    ③DCC基因是重要的抗癌基因，其失活与多种肿瘤的发生发展有关。失活方式包括杂合性缺失、点突变及表达缺失或降低。王东旭等研究认为：DCC基因在弥漫型组织中表达缺失率达30.7%，在肠型胃癌中DCC mRNA缺失频率高达44.4%。DCC基因产物具有粘附因子样功能，其表达异常可能会引起细胞关系异常，导致细胞的恶性转化，肿瘤的浸润与转移。DCC基因mRNA表达缺失多出现在临床Ⅲ-Ⅳ期及伴有淋巴结转移组，提示其表达改变在胃癌的进展和转移中可能起重要作用，检测胃癌患者有无DCC mRNA表达缺失对胃癌晚期诊断具有一定的价值。

    ④nm23基因定位于人染色体17q22，编码一种二磷酸核苷酸激酶。研究表明，nm23基因在某些具有高度转移性肿瘤细胞中，可出现表达下降，等位基因缺失及基因突变等改变。kodcra等对31例胃癌病人研究表明，nm23 mRNA的下降调节在胃癌转移和浸润中具有一定作用，使预后更差，而且与血液侵犯和淋巴结转移显著相关，与临床肝转移和腹膜转移无关。因此检测nm23基因有无异常表达降低对胃癌有无转移及预判断具有重要意义。

    ⑤cd44基因在胃癌中表达出不同的变异体，检测它们的改变有助于判断胃癌患者的预后。

    3、PCR在胃癌基因诊断中的价值
    基因诊断是国际上最权威的诊断，PCR是基因诊断的核心技术。由于它具有快速、特异、敏感的特点，在临床诊断中具有无比广阔的应用前景。胃癌的发生、发展过程中伴有多种癌基因及抗癌基因的变化，多基因表达异常同时检测对胃癌早期诊断、鉴别诊断和恶性程度的判断具有重要意义；特别是多重PCR完全能够实现多基因多表达同时检测，对胃癌的诊断具有更大的意义。其次，胃癌的浸润与转移是恶性肿瘤的重要特征，也是胃癌患者死亡的主要原因，许多胃癌患者虽切除了原发肿瘤，甚至连常规病理学等检查为转移阴性的患者，最终仍死于肿瘤的复发转移。

    因此，为了发现治疗后具高复发风险的肿瘤患者，采用更为敏感的微量肿瘤细胞检测技术是十分必要的，PCR技术是完全能够实现这一目标的。应用PCR技术从外周血、骨髓或淋巴结中检出少量肿瘤细胞有两种策略：一是检出肿瘤细胞中基因突变、染色体重排而产生的稳定性DNA异常，这一方法检测肿瘤细胞的敏感性为1×10-6左右，比Southern杂交提高104倍，二是应用RT-PCR技术扩增组织或肿瘤特异性mRNA，而它们在被检测的组织中呈高表达，目前检测实体瘤的微转移多用此法，其敏感性在1×10-6左右。

    最近研究表明，胃癌的预后与淋巴结转移、肝转移、肿瘤大小、病理分级分型有关，其中淋巴结转移是胃癌患者预后的最主要指标，有无淋巴结转移患者5年生存率统计学上有显著性差异(P<0.01)，因此检测胃癌患者有无淋巴结转移对胃癌治疗具有重要的现实意义。肿瘤的浸润与转移是一个多阶段过程。肿瘤细胞的脱落，侵袭并进入循环，仅是这一过程的最初阶段，但最终仅有少数病人形成转移灶，这种循环癌细胞转移的无效性可能是由于它们在循环中因机械、免疫等原因被消灭，同时残余的癌细胞还必须获得转移所需的遗传信息，如细胞调节机制改变，蛋白酶分泌，诱发血管生成，增加细胞运动等，一个癌细胞同时积累这些遗传改变的机会应是很稀少的，因此，转移的机理还需进一步研究。但是，少量癌细胞的存在常常是肿瘤复发与转移的基础。

    目前认为，用RT-PCR检测出微转移的患者多处于疾病进展期，当局部病变或治疗控制病情后则多为阴性，因此，微转移不仅是一个不良预后指标，而且还可作为疗效和早期复发监测的指标。应用PCR检测胃癌患者的微转移，受到缺乏胃癌特异性基因和高表达标记的限制，到目前为止，没有一种基因在全部胃癌组织中呈异常改变；同时还受到PCR技术本身的限制，一是因该方法高度敏感，可因上述原因出现假阳性：受检组织污染少量癌细胞或上皮细胞；基因组DNA的污染；®待检组织低水平表达组织特异性mRNA，二是RNA易被RNA酶降解而出现假阴性。解决上述问题可采用针对性措施：寻找胃癌中呈特异表达的基因并运用于临床；操作过程小心，防止污染；®对检测组织优化PCR反应条件；¯设计含有内含子参照基因的扩增产物，既可区别以DNA为模板的扩增产物，又可证明RNA样品的完整。尽管PCR在胃癌基因诊断应用方面受到一些限制，但随着癌细胞特异标志基因发现和增加反应特异性技术的不断进展，它将是检测胃癌微转移最令人瞩目的方法，并有着良好的临床应用前景。