胃癌的发病机理--癌细胞的特点与生活周期

    癌是人类生命的大敌，是生物学和医学中的重大理论和治疗问题。在理论上，了解癌症发生的机理，是克服癌症和治疗的必须步骤。一个正常的细胞是如何为癌细胞，其过程是极为复杂的，是细胞内外的分子环境发生了重大改变的结果。所谓细胞内外分子环境条件的变化，致使细胞从有节制的生理性生长变为无控制的癌症性生长，这要涉及一个分子生态学的概念。就分子水平而言，正常细胞有正常细胞的分子环境，它适合于细胞维持其生长和生活于生理学的平衡状态。一旦由于分子环境条件的改变，而打破细胞原来的分子条件，所的生理平衡状态则逐步地或渐进地（multistage）变为生长失去控制的癌细胞。这就是我们关于癌的发生是由于分生态失调的分子生态学观点。

    本章将就癌细胞的初期表型，正常细胞的生活周期性进行介绍，目的在于以分子生态学的观点，阐明细胞生活周期的原理是癌症发作的基础，对于阐明癌变理论和采取有防治措施，不无意义。

    一、癌细胞的特性
    在试管培养正常细胞的生长，有其很多特点，如贴壁生长、彼此接触的细胞停止生长，依赖于血清生长因子而生长等等。正常细胞有一定的寿命，在试管内传代培养一定代数之后，就要归于死。如有某种环境因素发生变化，则正常细胞的上述物点，也可发生变化，如贴壁生长，可变为悬浮长生、接触抑制现象消失，对血清生长因子的依赖减少等等。细胞生长的这些变化，我们统称为转化（transformation）。转化有程度之别。转化了的细胞，可在试管内长期传代而不致死亡，称为永生化（immortaization）。如果永生性细胞发生进一步变化，即接种于适当动物后，可以生长成为肿瘤，称为瘤化（tumorigenesie）或癌化（oncogenesis）。Tumor和onco都指癌，我们在这里特别指明一下,tumorigenesis指良性，oncogeneises或carcinogenesis指恶性，正常细胞同转化细胞，或瘤细胞的不同之点，是多方面的，也有程度的不同。瘤性或癌性转化细胞特点，列如表34－1。

    表34－1 试管中转化恶性细胞性质
    形态和生长变化
    细胞学变化
    ▲胞浆嗜碱性
    ▲核大小和数目
    ▲核浆比和细胞成团
    永生化
    密度依赖抑制性消失
    对血浆需要减低
    限制点控制消失
    细胞膜改变
    ▲凝集性
    糖蛋白／糖脂改变
    表面纤维凝集素消失
    ▲氨基酸摄取
    肿瘤相关抗原的出现
    生化改变
    ▲核酸合成
    ▼cAMP或▲cGMP／cAMP比例
    产生生长因子
    产生肿瘤发展基因产生
    敏感性宿主内成瘤
    ▲表示增加 ▼表示减少
    细胞发生转化的原因，有的是不知道的，所谓自然转化（spontaneous transformation），有的是已知道的，如化学致癌质、物理放射性和所谓肿瘤病毒，都可引起细胞转化，并发展为瘤细胞或癌细胞。这些都是来自细胞外的环境条件，这些条件引起细胞瘤化的机制，一直是研究的重点，希望从中得到有效的防治肿瘤的启示，是否也有细胞内环境条件的变化而导致细胞发生转化和瘤化呢？答案是肯定的，基因突变应属此类，以后的讨论，将会显示出这将是肿瘤的分子生物学和分子生态学的重点内容。

    二、细胞正常生长的调控机制
    对正常细胞生长条件的认识，是了解细胞癌变的基础， 先从细胞周期的调控谈起。细胞周期是指细胞完成一分为二所需的时序。静止的细胞，不进行分裂活动，称为G0期，周期开始于一个起始点，由此静细胞进入G1期，继之为S期，即DNA合成期，然后进入G2期，最后细胞一分为二，是为M（分裂）期。细胞周期的调控规律，多来自对单细胞生物如酵母菌的研究。近来对哺乳动物的细胞分裂，证实有同样的规律性。实验研究表明，细胞周期有两个关键的过渡控制点：一在G2／M的交接处，一在G1／S期。M期的特点在于M期促进因子的活化（activation of M phase promoting factor,MPF）MPF有激活性，激酶的作用于将磷（P）转移至底物蛋白，使其中的某一氨基酸残基磷酸化而改变这一蛋白的活性。MPF缺乏，则细胞分裂停止，MPF加入则可诱导细胞的多次周期性分裂。MPF由两个亚单位组成，分别为34D和45D，第一亚单位34为磷蛋白，在酶母细胞周期基因cdc2（cell division cycle gene,cdc2）编码，同Xenoqus MPF的P34蛋白亚单位有同源性；细胞进入M期，需要在这一亚单位的特定部位交替地磷酸化。第二亚单位是周期素（cyclin）家族的一员，周期素蛋白在细胞周期中起作用，细胞分裂期归于裂解，同时使激酶失去活性。

    G2／M和G1／S的进入部位，是细胞周期控制点，其性质受cdc2的活性和其他细胞素依赖性激酶的调控。
    通过对酵母的分子遗传学研究，对细胞周期的复杂调控分子网络，有一定的程度的了解，在调控基因网络中发现了激酶和磷酸酶的多种突变，可以增加或减少cdc2的调节活性，调节机制中各因素之间的互相交递，同细胞信号旁路所见的情况甚为相似。

    有几种蛋白能对P34激酶活化和去活化，这种激酶有几种细胞底物，见表34－2。
    表34－2 P34 cdc2激酶的作用底物
    底物
    磷酸化后的残基
    M期可能的作用
    板素B
    丝氨酸
    核基底瘤解体
 
    组蛋白H1
    丝／苏氨酸
    染色质浓缩
 
    PP60c-src
    丝／苏氨酸
    细胞骨架重排
 
    核仁素
    苏氨酸
    核仁解体
 
    RNA多聚酶Ⅱ
    丝氨酸
    转录抑制
 
    周期素B
    未知
    转录抑制
 
    SV大T
    苏氨酸
    未知
 
    表34－2中每一底物的磷酸化，都有其在细胞周期中的特殊意义，因为由于磷的获得致使底物蛋白发生功能性的改变，在某些情况下，P34激酶可能作为主宰调节者，（master regulator）而使底物磷酸化被磷酸化的底物又进而以典型的生化“十字军”（casade）对其他的细胞功能进行调节。另外，P34激酶还能直接磷酸化那些在周期中涉及功能调控任务的底物，如组蛋白H1蛋白，即是一例。

    P34周期素复合物对lamins的磷酸化，可能导致核膜溶解而有助于在分裂期形成梭状体。 lamins中的两个特别的丝氨酸残基已证明是M期激酶的靶点。这些靶点发生突变，则无磷酸化进行，也就可以防止核膜在分裂期解体。

    P34激酶的其他底物，在细胞周期中间可能有不同的磷酸化点，以致出现不同的结果，似乎这种磷酸化是过渡性的。这一现象以及M期激酶亚单位有周期性的活化和去活化的作用，都提示细胞分裂的发生，是底物蛋白的回复性（reversible）磷酸化的结果，即磷酸化状态适于细胞的分裂，而去磷酸作用，则使细胞回复至间期（interphase）状态。

    周期素（cyclin）有A、B两型，每一型都能同P34激酶组成特别的复合物，是使P34激酶表现特异的激酶活性所必需的。

    调节M期的控制机制，不管是在单细胞生物或哺乳动物细胞，都有下列共同点：

    （1）控制机制的中心因素是P34cdc2蛋白激酶，其活化诱导M期，高激酶活性维持细胞于M期，引酶与磷酸酶一同失活，则使细胞离开M期；
    （2）第二普遍成分是周期素，同P34cdc2激酶组成复合物，使P34cdc2激酶失活，并在细胞离开M期时裂解。这可能有助于P34cdc2激酶的失活。
    （3）P34cdc2激酶的活化同蛋白的磷酷氨酸和磷苏氨酸残基的去磷酸化相关。因为磷酪氨酸残基是ATP的结合部位，所以认为P34cdc2活化的部分原因是由于这一部位的改变。
    （4）在分裂的酵母和其他的微生物中，已鉴定有调节基因的网络存在，至少其中的cdc2可能有普遍意义；
     (5)近来更从多种细胞（从酵母到人）鉴定出一个新的蛋白P13sucl，能同P34cdc2紧密结合，抑制其活化，或促进其失活。

    在M期和S期之间通过P80cdc25作用于P34cdc2而建立起依赖链（dependendy link），不只见于酵母，也见于哺乳细胞，这些蛋白在S和M之间的链接作用，可以部分解释体细胞和胚胎细胞的细胞周期之间的差异。在转化细胞或早期胚细胞，DNA复制的封闭不能阻止同分裂发展有关的一些事件的发生。在正常未转化的细胞，P80cdc25的水平不高，而在胚胎细胞的水平较高，这不是一个限制因素（limiting factor）对依赖链的破坏发生影响，目前正在研究M期的调控机制是如何同其他的调控机制发生联系的，如对期程的调控，对细胞物质的调控，对生长速率的调控等。由于复杂的调控机制在正常细胞周期的调控得到阐明，那么在转化的细胞中，这些调控是如何受到破坏的，就会易于了解了。

    三、细胞的信号传递
    生长因子、分化因子和激素都是多细胞生物调控生长和发展系统的重要组成部分。它们通过与细胞表面受体结合并引起活化而起作用，这些受体都具有内在的蛋白酪氨酸激酶活性。很多受体蛋白都有相似的结构，细胞外糖化配体结合区,其长度可少至110AA到大于2100AA。大多数都有疏水性单一跨膜区，但至少有两种受体包括果蝇的sevenless酪氨酸激酶受体和人的ret酪氨酸激酶受体，有两个跨膜区，受体的胞浆区含酪氨酸激酶酶触区（tyrosine kinase catalytic domain）,由于配体结合区和蛋白酪氨酸激酶活性是被浆膜隔开的，所以受体活化必须越过膜屏障而到达胞浆，从而活化受体胞内区的功能。

    酪氨酸激酸受体可分为亚组，第一亚组为单体，胞外区含两个半胱氨酸丰富重复序列，表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）属之，第二亚组及其他。

    （二）受体的双体化与活化
    受体的寡聚体（oligomerzation）形成已见于EGF、PDGF（血小板来源生长因子）、CSF－1（细胞集落刺激因子-1）等受体；受体寡聚体化介导浆膜内激酶区的活化。配体与受体胞外区结合时，引起本区的构型变化，其结果是受体的寡聚化，最后一步是稳定两个邻近受体浆膜区的结合，并导致激酶功能的活化。这种信号传递不需要跨膜区中的AA残基发生部位的变化。单一配体如EGF，引起受体与受体结合为双体，双价受体如PDGF，CSF-1配体结合,亦使邻近受体成为双体。配引起受体的构型变化，使受体酪氨酸激酶发挥酶促作用，进行对外源性底物的磷酸化，也对自身的酪氨酸残基进行自身磷酸化。自身磷酸化受体上的部位，则因受体而异，在胰岛素受体，发生于胞浆区的β单位；在PDGF受体则发生于激酶插入处；在EGF，则发生于羧基端尾部。最少已知PDGF－B受体自身磷酸化的结果是使原癌基因raf-1产物中的丝氨酸／苏氨酸活化，活化了的raf-1癌蛋白又反回来同配体活化了的PDGF受体相结合。由此可知，受体活化分子生态条件是复杂的。

    蛋白酪氨酸激酶可分为两组，一为受体依赖组，一为无受体组。上面提到的是关于酪氨酸激酶与受体的关系，这是提一下不同受体联系的酪氨酸激酶。

    非受体酪酸激酶（non-receptor tyrosine kinase）没有胞外序列和跨膜序列，但同浆膜的浆面相联系，在信号传递和信号放大中起着重大作用。这一组的典型成员有src、lck、fyn等。Src在以后讨论，这里简介一下lck 和fyn。

    Lck蛋白激酶的mRNA常见于正常淋巴样细胞，但也见非淋巴瘤细胞系，lck确切功能尚不清楚，但知其氨基端联系于T细胞（T4，T8）的TCR复合体，lck同TCR糖蛋白结合可能对激酶活性有调节作用，并有助于T细胞的活化。

    在两个不同来源的鼠淋巴瘤细胞系中，都见有lck基因的重排和过度表达。在人非Hodgkin淋巴瘤细胞系中，定位于1P32－35不正常的染色体，此外，在人肠癌和肺癌细胞中常有过渡表达。Lck与细胞瘤化的关系，尚待深入研究。

    T细胞抗原受体活化，引起TCRξ链和其他细胞内底物的磷酸化，在发现了CD4／CD8－lck复合体之后，又发现了fyn癌基因蛋白，也是一种非受体性酪氨酸激酶，也同TCR有联系。可能同lck一样，在淋巴瘤发生中有一定的作用，两者都可能有信号传递的功能。

    （三）G蛋白
    G蛋白（guanine triphosphate-binding protein）是一个信号传递家族，能将胞外信号通过跨膜区传至膜内面的效应蛋白，浆内产生的第二信号对胞浆蛋白的活性起调节作用。这一传导现象，是由一种效应蛋白的开关作用来完成的，G蛋白的活化型或去活化型的构型变化，则是开关效应蛋白的关键。参考G的结构与功能模式图。

    G蛋白由α、β、γ三部分组成，α对一定的受体和效应蛋白显示特异的结合性，所以在每一G蛋白存在独特性。G蛋白提供的结合点，除同鸟核苷（guanine nucleotide）结合外，还使GTP水解。G同GTP结合时，为活化型，GTP水解后而变为GDP时，则G变为失活型，这主要由α蛋白起作用，β和γ则帮助组成紧密的功能复合体，以使G铆于浆膜上，并导致α蛋白趋向于受体成分，β不像α那样富于变化性，β、γ对于不同的G蛋白可以交换作用。

    激素常作为配体，剌激并活化受体，促进G蛋白的α链释放GDP，同时让β、γ与α离开，并促使GTP与α结合，就是与GTP结合状态下，α才能调节效应蛋白（酶）的活性，例如腺苷环化酶或一条离子通道（ion channel）。GTP水解，使α又同GDP结合而成为无活性状态。

    G蛋白活性，既可表现为刺激性，如见于正肾上腺素与其受体结合所导致G蛋白活化，又可分为抑制性如见于生长激素抑制素（somatostatin）和α2肾上腺素胺（adrenergicamines）所导致cGMP的活性抑制。在前者G蛋白称为Gs,在后者G蛋白称为Gi。G蛋白活化与失活化周期的突出特点，是将配体引起的受体的激活同效应蛋白的活化分开，并对传导信号进行调节和放大。酶活化的Gs-腺苷环化酶复合体的生命期，决定于Gs－GTP结合时间的长短，而不决定于配体与受体结合的稳定性（tenacity）。

    对G蛋白特点的认识，来源于细菌毒素的研究。霍乱毒素和百日咳毒素的原始靶点都是G蛋白，两种毒素都能从NAD+酶解ADP-戊糖并使之转移至G蛋白α链的不同AA残基。霍乱毒素改变Gas以稳定α结合GTP的活化构型，并加强对腺苷环化酶的剌激作用，结果使肠粘膜细胞的cAMP 水平升高而致霍乱腹泻。百日咳毒素也使G蛋白改变，但使其不能同受体正常结合。Gi样蛋白所介导的激素效应，都是封闭性的，如对腺苷环化酶的抑制、K＋管道的开放、磷酸肌醇代谢的剌激等。

    苷环化酶活化的结果，是cAMP水平升高，在哺乳动物细胞，这一所谓胞浆第二信号，介导很多种激素作用，如储存能量的动员、Ca2＋的稳定平衡、血管压素介导的肾水储、心肌收缩的提高等。在真核细胞中，cAMP所起的作用是同蛋白激酶结合并活化之。在激素刺激过去之后，细胞内cAMP活化终止的途径，可能是多方面的。很多种细胞产生一种蛋白激酶抑制因子（PKI,protein kinase inhibitor），非特异性磷酸酶使激酶作用过的底物进行回复性磷酸化，多种环核苷磷酸二酯酶分解cAMP为5’AMP等。

    （四）Ca2+磷酸肌醇信号旁路
    酪氨酸激酶、G蛋白、各种激素等各自同其特异的受体相互结合，把不同的信号从细胞传至细胞浆和核的各种蛋白以调整细胞的生长。磷酸肌醇通过膜磷酯的作用而成为信号传递的又一重要系统。

    很多种激素、神经介质和生长因子的受体剌激PLC活化，从而特异地导致磷酸肌醇4，5二磷酸（PIP2）酸。PIP2为细胞的磷脂成分，分解为两个第二信号分子，即IP3和DAG，分别为inositol-1,4,5-triphosphate和diacylglycerol的缩写，DPG停留于膜中激活蛋白酶C（PKC），IP3为水溶性，弥散至胞浆，以释放胞浆储存泡（storage resicles）中的Ca2＋。此胞浆Ca2＋结合于calmodulin（钙调节蛋白），具有调节酶活性（包括Ca2＋依赖性蛋白激酶）的作用。IP3本身可转换为另一第二信号分子IP4（inositol-1,3,4,5-tetraphosphate）。PLC水解PI和PI2时，激活PKC、IP、PIP2的水平紧密地受激酶和磷酸酶的调控，而这些又受到原癌基因蛋白和酪氨酶激酶的调节。

    信号系统的PKC股和cAMP旁路彼此有相似之处，都能在多种靶蛋白上使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，两者都被第二信号分子激活，但磷酸肌醇旁路远较cAMP／蛋白激酶A旁路复杂。例如，除了一般的Ca2＋／钙调蛋白依赖性酶能磷酸化很多蛋白底物外，不同类型的细胞还含有不只一种特异的Ca2＋／钙调蛋白依赖性激酶，这些酶具有限制性底物特异性。而且，已至少鉴定出在结构上可以区别的四种PKC，各具有不同的调节酶促性、组织分布性和底物等特异性，某些信号分子和激酶在旁路中，依细胞类型和生物学应答作用不同，而有程度上的差异。磷酸肌醇旁路，可能有药理学上的应用意义。胞内Ca2＋水平，可用钙离子载体（Ca2＋ ionophores）进行提高。PKC可受佛波酯和人工合成DAG的结合而被直接剌激，Ca2＋和PKC在引起生理学的反应中，不一定是各自独立的工作，在血小板、中性粒细胞、T细胞和胰外分泌细胞中，这二者都是协同工作的，在肝细胞中，血管压力素剌激PIP2分解而加强肝淀粉的降解。在这一系统，旁路的Ca2＋股作用于磷酸酶激酶的活化和肝淀粉的破坏，而PKC股则作用于阻断肝淀粉的合成。

    Ca2＋／PI信号旁路，可有多种终止其的途径。IP3和IP4能很快去磷酸化而变为无活性产物，DAG能磷酸化而产生phosphotidic acid，此又可转变为磷脂或去乙酰（deacylated）而生成花生四烯酸（arachidonic），Ca2＋泵能从胞浆主动的除去Ca2＋。

    产生Ca2＋和DAG除靠分解PIP2外，还有别的途径，浆膜去极化使电压操纵的Ca2＋管道开放，可使浆Ca2＋水平升高，DAG能被PLC生成。病毒和细胞的转化蛋白，常能窃据这一强而有力的生长信号旁路而为已用。

    综上所述，不难明白，cAMP/PKC和Ca2＋／PI两条信号旁路，不是彼此独立的，而是相互协作的，但有时是平行作用的，有时也是互相对抗的。例如，在肝细胞，二者相互协作剌激葡萄糖的释放以应答肾上腺素的剌激，另一方面，血管压力素剌平滑肌收缩，是IP3介导Ca2＋的动员所致，但cAMP水平升高，则是导致平滑肌的舒缓，所以二者的作用又是相反的。

    （五）信号传递与胞核联系
    很明显，有一个复杂的旁路网络系统，将各种信号从胞外，经由膜表面分子受体结构，通过胞膜到达胞浆，最后传至胞核，以便对不同的环境条件产生应答。对受体剌激所引起的信号传递，常常不是停止于胞液（cytosol）系统，而是要到达核内，影响具有生长调节功能的某些基因的转录。

    很少有一条旁路能从胞膜直接追踪至核，已检定出一些核蛋白，有的是癌基因产物，它们的功能性尚不很清楚。一般而言，它们可能是基因调节蛋白，对细胞的分化增殖起作用。所有细胞分裂刺激的信号传递旁路，必然且必须要在某一点同核蛋白相联系。用PDGF作用于细胞，就很快见到c-fos癌基因蛋白的水平升高，继之其他的核蛋白水平也升高，包括c-myc 癌基因蛋白，有证据表明，几种核蛋白可以彼此作用，但少证据核蛋白与信号旁路之间的直接联系。

    有三种类型的核蛋白存在，虽有相似的性质，但有可区别的特点，第一组核蛋白包括c-myc，主要见于核内，代谢率特别快，以中等亲和性同单股或双股DNA结合，但无特异性；第二组核蛋白包括c-myb、c-fos、c-jun,都属转录因子，能调节其他基因的表达，这些转录因子，能彼此影响与DNA结合的能力；第三组核蛋白为DNA肿瘤病毒，如SV40编码的大T抗原，能特异性地和非特异性地同DNA结合，但这种结合不一定同转化有必须的联系。SV40蛋白能在浆膜中查到，某些AA序列的突变，可使其有效的从胞浆转运至核内，在转化细胞的核内，可见大T抗原结合P53蛋白的基因，这一基因编码的P53蛋白，为核磷蛋白，能抑制捉瘤基因的表达。这些核蛋白如何作用于信号旁路和如何对细胞生长机能进行调控，尚不清楚，但有理由相信，生长剌激旁路中的核因子的复杂性和同调节作用联系的紧密性，如同胞浆中所见的相似，其终末结果是对细胞生长分化的准确调节和生理平衡。

    但组织严密的信号传递旁路的复杂性和多步骤性，不是完全没有离开常规的可能性，这就是细胞转化甚至癌化的可能性根源。

    任何变异的细胞化周围未变异的细胞，显示生长的优势时则出现竞争性增殖（competitive proliferation）。对环境进行应答而显示正常生长能力的细胞和失去调控而生长成为瘤的细胞之间的差别，仅在于瘤细胞在其演变过程中，逃脱了正常反馈的调控机制，细胞变异发生转化的情况，是千变万化的。在已积累了大量关于细胞生长剌激信号旁路机制知识的条件下，有可能对一不适当的活化旁路的机制（例如细胞癌基因的活化）进行探讨，这就是我们要在下一章要讨论的内容。