肾癌生物治疗进展

    blair（1997年）统计美国近年来每10万人中死于癌症的患者，1994年为200．9人／10万，而1970年则为189.6人／10万。1994年的死亡率反高于1970年，说明20年来有关癌症的治疗未取得突破性进展。在癌症的防治工作中，结论是预防胜于治疗［1］。

    根据美国国家癌症研究所（NCI）肾癌专题会议总结（1997年），肾癌的发病率（1975～1990年）增高了54％，仅在1996年，即诊断了近30000例新的肾癌。同年，有12000例患者死于本病。吸烟是重要的危险因素。高血压、高蛋白饮食、服用利尿剂及抗高血压药物也有一定的影响。将近一半的肾癌患者首次来院就诊时即已属晚期，约40％的患者术后复发或转移，未接受治疗者3年存活率低于5％，预后不良［2，3］。

    肿瘤抑制基因（VHL）及Wilm肿瘤抑制基因（WT1）被认为与肾癌的发病有关。WT1可调整原癌基因bcl-2与c-myc［4］。染色体基因分析，发现在肾癌中第3号染色体短臂处存在VHL基因。在肾脏透明细胞癌中，VHL突变及杂合子缺失的百分率很高，在染色体3P13处发现DNA顺序缺失者高达97％，而VHL突变者为50％～60％。进一步发现VHL基因可调节血管内皮生长因子（VEGF），肾癌的血运非常丰富，VEGF表达很高，抑制VHL可能减少肾癌的血管形成［3-6］。1996年克隆出FHIT基因（for fragile histidine riad），该基因位于染色体3P-14、2，与酵母中的基因顺序类似，几乎所有的肺癌与食道癌、85％的肾癌、76％的宫颈癌、40％的结肠癌、30％的前列腺癌均有FHIT基因的缺失，故认为是一种新的抑癌基因。

    肾癌中的染色体端粒酶活性亦有所增强，提示该酶在肾癌的发病中起到一定的作用，亦可作为肾癌的标记物。

    肾细胞癌对放疗与化疗均不敏感，这给晚期肾癌的治疗带来一定的困难，肾癌细胞具有多药耐药基因（MDR-1），细胞内的P170蛋白能将进入癌细胞内的化疗物质泵出细胞外，故一般化疗的效果＜10％。而免疫治疗有一定的疗效，IL-2现认为是治疗转移肾癌的标准制剂，IL-2为T细胞的生长因子，对癌细胞并无直接的抗肿瘤细胞毒性作用，但可扩大T细胞数量，刺激活化了的T细胞增长，增强患者的免疫反应［2，3］。
    rIL-2
    iL-2于1992年被FDA批准应用于治疗晚期肾癌，Rosenberg（1985）首先采用大剂量的IL-2治疗肾癌，通过对255例患者的临床总结，大剂量的IL-2可使部分患者的肿瘤全部缓解（CR）或部分缓解（肿瘤缩小50％，PR）［2，7］。总缓解率约为15％～20％，全部缓解者平均生存时间为40个月，部分缓解者为24个月。＞75％的CR患者可维持无瘤期3年以上，少数甚至超过5年。Rosenberg采用的IL-2剂量为720000IU／kg，静脉推注，每8小时一次，每周5次。副作用大，初期治疗的患者，半数以上需要使用升压药维持血压，7％的患者行气管内插管进行辅助呼吸，少数患者需要行透析治疗，死亡率近4％。患者表现高热、寒战、呕吐、腹泻，伴有心、肺、肝及肾功能不全。一般肾功能不全为肾前性氮质血症，其主要的病理生理机制为毛细血管渗透性增加，血浆外渗，致使血容量下降、器官间质水肿、低血压、水潴留及少尿，称之为毛细血管漏征候群（capillary leak syndrome），停药后副作用可于短期内恢复［2］。最近5年采用大剂量IL-2治疗的患者，则无一例死于IL-2治疗［7］。这种治疗方案不仅副作用大，而且药物价格也非常昂贵，恐难在国内推广使用。但就晚期转移肾癌而言，IL-2虽不能治愈肿瘤，但可抑制其生物进程，甚至可使肿瘤暂时消退，应该是肾癌治疗上的重大进步。Mankaff等［8］报道1例经大剂量IL-2治疗后的PR患者，采用FDG（18F-Flurodeoxy glucose）-PET扫描观察，发现肿瘤不能摄取FDG，提示肿瘤细胞已经死亡，手术时发现一个巨大坏死性肿物，病理检查不到活的癌细胞。患者已经观察30个月无肿瘤复发，并已经恢复全日工作。PR患者虽然肿瘤尚存在，也能取得类似CR的效果。

    虽然大剂量IL-2治疗肾癌已10余年，但总的缓解率未能进一步提高，副作用也较明显，故应进一步寻求更好的治疗方案。
    yang等［9］曾对260患者使用3种不同剂量的IL-2及不同的应用方法以观察其疗效：（1）大剂量静脉推注组，720000IU／kg每8小时一次。（2）小剂量静脉推注组，72000IU／kg每8小时一次。（3）皮下注射组，120000IU／日，每周5次。
    结果：大剂量组缓解率为20％（3％CR，17％PR）；小剂量组为15％（7％CR，8％PR）。大剂量组的缓解时间长于小剂量组，但毒性反应显著，52％的患者表现低血压，需注射血管收缩剂。而小剂量组发生低血压者为3％。就缓解率、缓解时间及总的存活率而论，大剂量组IL-2静脉推注优于小剂量组，但缓解率小剂量静脉推注组亦可取得较好的效果，故认为也是治疗转移肾癌的有效方法。皮下注射组的毒性与缓解率与小剂量静注组类似，由于皮下注射的用量低、毒性小及可在家中注射，现已逐渐为大家采用。

    INF-α
    1983年即已开始应用干扰素INF-α治疗转移肾癌。根据900余例的临床总结，缓解率为18.4％，缓解期为6～10个月，但很少有CR者。一般每日10～20MU／m2，症状轻、体积小的肿瘤反应较好。在鼠的肿瘤模型中，INF-α可增强肿瘤细胞MHC的表达，使肿瘤抗原能呈送给T细胞，激活T细胞。INF-α也可降低肿瘤中的bFGF表达，减少肿瘤中的新生血管形成。近来更认为INF-α可通过转导转录信号（STATs）影响细胞的增殖［10］。
    iL-2与INF-α合用治疗晚期肾癌，缓解率近20％，约5％的患者表现CR，疗效稍优于大剂量IL-2或与之相等。
    iNF-α加CRA（Cis-retinoic acid）
    采用3～9MU／日INF-α2a加每日1mg／kgCRA，43例患者中13例缓解（30％），3例为CR，10例PR，平均缓解时间22个月。提示二者合用有附加效应，可能比单用INF-α更好［3］。

    生物化疗
    atzpodien（1996年）报道采用皮下注射IL-2同时给予INF-α及5FU治疗转移肾癌，取得了较好的效果。由于皮下注射IL-2，毒性反应大为减少。所有患者均可在家中进行治疗。从1988年10月至1993年6月，120例患者经治疗后，13例（11％）肿瘤完全缓解，32例（28％）部分缓解，总缓解率为39％。18例PR患者，肿瘤减少了90％，CR患者无瘤期为8～47个月，平均15个月；PR患者肿瘤减小2～31个月，平均11个月。5％的CR患者完成治疗后长期无肿瘤复发，所用剂量为皮下注射IL-2（20MU／m2）、INF-α（6～9MU／m2）及静脉推注5FU750mg／m2［11］。本组病例无中毒致死者。另一组报道缓解率则达47％。Gebrosky等［12］报告21例晚期肾癌，仅采用每日5FU200mg／m2静注及INF-α-2b1×106IU皮下注射，结果9例（43％）缓解，CR4例（19％），PR5例（24％）。CR的平均存活时间为195周，PR患者184周。这组患者未使用IL-2，5FU的剂量亦较小，但治疗时间长达6个月。上述资料说明晚期肾癌的治疗缓解率已经从原来的20％上升至40％左右。

    过继免疫治疗
    过继免疫治疗常将具有抗肿瘤性能的淋巴细胞在体外培养增殖以扩大其细胞数后，与一些生物反应调节剂再输入患者体内，以求提高肿瘤的缓解率并延长缓解的时间。

    1.肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）：将切除的肿瘤组织制成悬浮液与IL-2行体外培养，经一段时间后，肾癌细胞死亡，T淋巴细胞则继续增长，最后TILs数可达2～3×1011，然后将增殖的TILs输入患者体内。TILs为已被肿瘤抗原激活的CTLs（cytotoxic T lymphocyte），对肿瘤靶细胞有特异性，输入体内后可返回肿瘤。LAK细胞则无这种功能。动物实验证明TILs比LAK细胞的抗肿瘤作用强50～100倍，美国加州大学（U-CLA）采用IL-2小剂量静注，加用INF-α及TILs治疗晚期肾癌，62例患者中5例CR（9.1％），14例PR（25.5％），无显著毒性，现已列为该校治疗晚期肾癌的标准治疗方案［13］。

    2.树突状细胞（DC）：树突状细胞是近来免疫学家及肿瘤研究工作者最为关注的课题之一。DC在体内的含量甚少，不足人体血液细胞的1％，但具有强大的免疫激活作用，过去强调免疫反应发生在抗原与T细胞之间，实际上仅抗原与T细胞尚不足以引起免疫反应，DC才是引起免疫反应的引发细胞（initia-tor），树突状细胞表面有很多细长（＞10μm）的细丝，本身能移动，故适于捕捉抗原，然后呈送给T细胞，DC获取抗原后，即从不成熟的DC转变为成熟的DC，形态发生很大的改变，同时捕捉抗原的功能减退，活化T细胞的功能则加强。DC的两大主要功能即为捕捉抗原，然后递呈给T细胞，激活T细胞。不论在体内或体外，仅少数DC即可激发强烈的T细胞反应。一个树突状细胞可激活100～3000个T细胞，所以DC作为抗原呈递细胞，比巨噬细胞及B淋巴细胞更为有效。DC表面的MHCⅠ及MHCⅡ组织相容性抗原比单核细胞及B淋巴细胞高出10～100倍，同时也具备激活T细胞的第二信号共刺激蛋白B7.1／CD80及B7.2／CD86以及其它粘附分子，DC本身也可制造IL-12，INF-α等重要细胞因子［14，15］。此外DC尚可分泌DC所特有的趋化因子DC因子（DC-CKI），该因子对幼稚T细胞（NaiveT细胞）具有特别的吸引力［16］。DC的另一个特点为DC进入血液后，最后回归到二级淋巴器官，将抗原呈递给停留于该处的多数幼稚T细胞，使幼稚T细胞被激活为对抗肿瘤的CTLs。Albert最近报告人的DC能有效地将来自凋亡细胞的抗原如肿瘤及移植物抗原呈送给CD8细胞使其成为CTL［17］。

    肿瘤细胞一般MHC表达下降，B7亦减少。故单纯肿瘤抗原不足以激活T细胞，尚需借助抗原呈递细胞才能获得有效的免疫反应，DC在这方面担当了重要的角色。

    在体外，以GM-CSF及IL-4进行DC培养时，可使DC大量扩增。IL-4为DC的生长、分化所必须的细胞因子，GM-CSF只作为培养时的生存因子［16］。在体外扩增时，可将肿瘤的特异抗原转导给DC或将抗原与DC融合后再输入体内［18］。DC也可在体内进行扩增，FLT-3L（fetal liver tyrosine kinase recep-torligand）为一强大的造血细胞生长因子，给予FLT-3配体能增加DC的数目与活性，动物实验（lynch）每日注射人类重组FLT-3L后，鼠体内的DC大量增加，40％的纤维肉瘤完全消失。其余的肿瘤生长亦显著地被抑制。体内扩增比体外简单易行，现正进行临床初步试验［19，20］。

    最后，CTLs与肿瘤细胞相遇后，分泌穿孔素及颗粒酶B，激活细胞浆内的半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease）或称Caspase，能将细胞的骨架、DNA切断，使癌细胞凋亡［21］。
    抗血管形成
    抗血管形成为治疗肿瘤的一肿新概念，任何实体瘤的生长与转移均有赖于新生的血管形成（angiogenesis），缺乏新的血管形成，肿瘤的生长很难超过1mm3，只有新的血管形成后，肿瘤才能迅速增长，Folkman1971年即已着手这方面的研究。
    正常的血管内皮仅约0.01％的细胞在增殖。正常血管内皮细胞能分泌血管形成抑制物质throm bospondin以保持血管于静止状态。一旦癌基因活化，p53或VHL突变，则血管形成因子增多。肾癌中的血管形成因子主要有血管内皮生长因子（VEGF）及bFGF。VEGF只作用在血管内皮，对其它细胞则无促生长作用，故对新生血管的形成具有特异性。VEGF在促进血管新生的同时可增强血管的渗透性，使癌细胞易出入血管，向远处转移。新生血管的形成可视为血管形成物质与血管形成抑制物质平衡失调的结果。

    在新生的血管内皮中，存在VEGF的特异酪氨酸激酶受体（receptor tyro-sine kinase，RTK）或称FLT-1（fetal liver tyrosine kinase）。FLT-1在正常的血管内皮表达很低，而在肿瘤及肿瘤附近的血管则呈高表达，肿瘤中的FLT-1与VEGF的结合力比另一种VEGF受体KDR（kinase domain region）强100倍，故VEGF-FLT-1RTK系统对新生血管的形成，具有关键性的作用。采用VEGF的抗体几乎可完全阻断肿瘤及新生血管的生长，消灭一个血管内皮细胞即可防止100个癌细胞生长［22，23］。

    临床上也发现肿瘤的微血管密度与癌转移及患者的存活率相关。
    癌细胞除分泌血管形成因子外，同时也制造其它抗血管形成物质，有些非肿瘤组织也可制造抗血管形成物质如INF-α，INF-诱导蛋白-10及CXC趋化因子等［3］。具有临床意义的是O’Reilly等［24］于Lewis肺癌中发现的angio-statin。angiostatin为一种相对分子质量38000蛋白，相当于人类纤维蛋白酶原（plasminogen）中的一片段，对阻止血管形成具有强大的活性［24］。其后Gatley等［25］（1996）发现人类的各种前列腺癌细胞株PC-3、DU-145及Ln-CaP等均能产生丝氨酸蛋白酶（serineprotease），它能将纤维蛋白酶原分解成angiostatin，并认为人类的前列腺癌发展相对缓慢可能与此有关。O’Reilly等［26，27］又于鼠的血管内皮瘤中分离出相对分子质量20000的蛋白endostatin，endostatin的结构类似胶原ⅩⅧ中的羧基端，两者对鼠类肿瘤均有强大的血管形成抑制作用，占体重2％的肿瘤经上述制剂治疗后，缩小成体积1mm3的镜下病灶，肿瘤缩小150倍，有些肿瘤则完全消失，镜下也找不到癌细胞。停药后11个月未见复发，肺部亦未见转移，对照组则均发现有肺转移。多次应用未发现耐药，亦未见毒性反应，现正进行临床观察。

    肿瘤新生血管的细胞分子结构亦有所改变。新生血管的细胞粘附子整合素（integrin）为αVβ3，与原有的血管细胞整合素不同。整合素不仅是细胞间的粘附蛋白，亦与细胞内的骨架相联合，并充当细胞内向外及细胞外向内的信使，对细胞的功能具有重要影响。故认为αVβ3也可作为治疗肿瘤的靶标，Arg-Gly-Asp（RGD）能选择性地与αVβ3结合，故可将抗癌药与RGD结合后运送至新生的血管，也可直接用αVβ3的单克隆抗体治疗肿瘤。Brooks等［28，29］报告采用αVβ3mAb可迅速引起新生的血管细胞凋亡，而对原有的正常血管则无影响，对人类肿瘤亦具有同样效果。

    单克隆抗体
    肾细胞癌的特异性抗原G250已被确定并进行克隆，现在进行研究G250能否作为肾癌的特异性抗原制备肿瘤疫苗。抗G250的单克隆抗体（mAbG250）能与所有的肾透明细胞癌及大多数的非透明细胞癌结合，但与正常肾细胞则不发生反应。用131I标记的mAbG250可使肾癌成像，比传统的成像技术更为敏感。90％以上的肿瘤，不论原发或肝、肺、骨及淋巴结转移癌均能显影成像。经手术证实而未被CT及MRI发现的转移癌亦能被131ImAbG250显像，所发现最小的肿瘤仅8mm。由于肿瘤摄取mAbG250量很高，故可考虑对肾癌以碘标记的单克隆抗体进行放射治疗［30，31］。

    IL-12
    iL-12在动物实验中有较强的抗肿瘤效应，临床上曾试用以治疗晚期转移肾癌，但曾引起两例患者死亡，故试验一度中断。IL-2与IL-12合用或IL-12＋IL-18可能比二者单独应用更为有效。IL-12亦具有抗肿瘤的新生血管形成效应，并可加强INF-α的抗肿瘤效果，但临床应用肿瘤缓解率却不甚明显，现正进一步观察其疗效［3，32］。

    基因治疗
    肿瘤的基因治疗尚处在早期发展阶段，全世界的200余种临床治疗方案，至今无一种方案认为是成功的。1990年世界上第一例腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症曾一度宣扬为基因治疗的成功范例，现仍需要继续注射人造ADA，表明基因治疗未取得成功。基因治疗的主要障碍在于缺乏有效的基因载体，能将基因转导给癌细胞［33］。Huang（1998年）曾试用类似乳糜的脂蛋白作为载体，可使基因的转导成功率达到10％。而用脂质体则只能达到0.5％［34］。Harrington（1997年）试制成功了约为正常人染色体1／5大小的人工染色体（HAC），将HAC转导给鼠细胞，半年后仍保持功能稳定，细胞继续进行有丝分裂。故现希望采用人类人工染色体的转导以代替现有的基因治疗或转导第3号染色体治疗肾癌［35］。

    肿瘤的发病原因甚为复杂，根据Volgestein结肠癌的基因模型研究，癌基因的突变及多个抑癌基因的缺失，是癌瘤发生的主要特征，只作某单个基因的置换来治疗肿瘤，难于取得成功。实验研究常采用野生型p53基因治疗肿瘤，认为p53诱导的细胞凋亡是个体防止肿瘤发生的重要防御机制。
    volgestein实验室于1997年建立了p53诱导细胞凋亡的分子模型。p53在缺氧、放射、紫外线照射及化疗药物的刺激下，可被激活。激活后的p53可转录14种基因，这些基因制造的蛋白可产生大量的活性氧因子（ROS），破坏线粒体的细胞膜，使细胞膜的膜电位及渗透性发生改变（PT），细胞膜上的孔、道增大（megapore），线粒体内的细胞色素C及Ca2＋外流，最后活化细胞浆内的半胱氨酸蛋白酶或称Caspase及CAD（caspase activated DNA se），而将DNA切断使细胞凋亡［36，37］。转染p53基因治疗晚期肺癌曾有报道，但效果并不显著，肿瘤的基因治疗短期内尚难取得突破。NCl在1997年声称，该所下世纪初的战略目标为基因诊断，基因诊断将为下一世纪的医学发展铺平道路，基因治疗尚需作大量的基础工作，估计10年后才能有所进展［38］。