肺癌新药对癌细胞的抑制作用

        目的：研究益肺清化颗粒对肺癌细胞的抑制作用。
　　方法：使用血清药理学的方法，体外观察益肺清化颗粒含药血清对两种不同的肺癌细胞株(PG、PAa 细胞株) 的抑制作用。结果：益肺清化颗粒含药血清具有一定的抑瘤效果，抑瘤率为23.0 %～36.2 % ，且以较高浓度时抑瘤作用显著；但总体来说，抑瘤作用要明显弱于化疗药物顺铂。结论：益肺清化颗粒对肿瘤生长具有一定的抑制作用。
关键词：益肺清化颗粒药效学　肺癌细胞株/ 药物作用　体外
实验
　　中图分类号：R273 　　文献标志码：B
　　当前，肺癌居我国城市人口肿瘤发病率的首位，已成为恶性肿瘤中最常见的死亡原因。医学界普遍认为，提高肺癌疗效的措施是进行多学科综合治疗，其中中医药治疗占有重要地位。益肺清化颗粒是朴炳奎主任医师积多年临床经验，并经国家“七五”攻关进一步开发而研制出的治疗肺癌的有效方药。笔者以血清药理学方法研究了其对肺癌细胞的抑制作用，现报道如下。
1 　材料与方法
1.1 动　物
　　健康日本大耳白白兔，体重210 kg ，雄性，由中国医学科学院药物所提供。
1.2　瘤　株
　　PG为人高转移性巨细胞肺癌细胞； PAa 为人低转移性肺腺癌细胞，均由北京大学医学部病理教研室提供。
1.3 药物与试剂
　　益肺清化颗粒，组以黄芪、沙参、党参、麦冬、桔梗、紫菀、拳参、仙鹤草、白花蛇舌草等。二甲基亚砜(分析纯) ，由江苏无锡医疗器械经销公司分装； 甲基噻唑基四唑(MTT) ， Sigma 公司产品； RPMI1640 培养基，GIBCO 公司产品；新生牛血清，中国杭州四季青生物工程材料有限公司提供。
1.4　仪　器
　　酶标仪， ∑960 型，美国贝斯特公司产品；细胞培养箱，SANYO 公司产品。
1.5 　方　法
1.5.1. 药物血清的制备
　　将9 只健康日本大耳白白兔，随机分为高剂量药物组、低剂量药物组、空白组3 组，每组3 只。每组每天早晚各给药1 次， 每次10 mL/ kg。其中高、低剂量组剂量分别是28 g/ kg、14 g/ kg ，分别相当于人等效剂量的10 ，5 倍；空白组给以等量生理盐水，连续给药3 d。末次给药前12 h 禁食不禁水，末次给药后1.5 h 分别从耳中央动脉无菌采血10 mL ，室温静置2 h ，待血凝坚实、血清析出后，1500 rpm 离心10min ，取血清，56 ℃30 min 灭活， - 20 ℃保存，1 个月内使用。药物血清剂量的确定：根据预实验结果取高剂量组含药血清(预实验结果示低剂量组血清抑瘤作用极弱，故弃去) 分别加入无血清RPMI21640 培养液中稀释至终浓度为15 %、30 %进行实验，以观察不同浓度的药物作用。
1.5.2 　细胞培养
　　肿瘤细胞均培养于含10 %小牛血清、100μ/ mL 青霉素和100μg/ mL 链霉素的RPMI21640 培养液中，取对数生存期的细胞用于实验。
1.5.3 　对PAa、PG细胞抑制率的测定
　　参照文献 ，采用MTT法检测益肺清化颗粒对细胞增殖的抑制作用。取对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，1×105个/ well 铺于96 孔板，过夜后加入以无血清RPMI21640 培养液配制的益肺清化颗粒药物血清，同时设顺铂组(2μg/ mL) 作为阳性对照，空白对照组仅加入相应体积的无药血清培养液，每一浓度设6 个平行孔，继续培养72 h ，弃上清，每孔加入PBS 溶解的MTT 100μL (1 mg/ mL) ，37 ℃5 %CO2 细胞培养箱孵育4 h ，弃上清，加入DMSO 100μL ，震荡器轻微震荡10min 后，于酶标仪550 nm处测定各孔的吸光度(OD 值) ，按下列公式计算抑制率，并进行统计学检验。 细胞抑制率=[ 1 –(A加药组- A空白组)/A对照组]×100 % 1.5.4 　统计学方法 　　采用SPSS 1010 统计软件进行，组间比较采用t 检验。 2、结　果 　　15 %含药血清和30 %含药血清对PAa 细胞的抑制率分别为28.2 %、34.5 % ，两者比较无显著性差异；而顺铂的抑制率为66.4 % ，与前两者比较有非常显著性差异( P < 0.01) 。15 %含药血清和30 %含药血清对PG细胞的抑制率分别为23.0 %、36.2 % ，两者比较有显著性差异( P < 0.05) ；而顺铂的抑制率为71.3 % ， 与前两者比较有非常显著性差异( P < 0.01) 。见表1。 表1 　不同药物及浓度对肿瘤细胞抑制率的比较

药物	对PAa 细胞抑制率/ %	对PG细胞抑制率/ %
15 %含药血清	28.2	23.0
30 %含药血清	34.5	36.2
顺铂(2μg/ mL)	66.4	71.3

　　注：与30 %含药血清组比较， 3 P < 0.05 ；与顺铂组比较， △△ P < 0.01。 3 　讨　论 3.1 益肺清化颗粒组方依据及有关研究报道 　　益肺清化颗粒(上市前名为益肺清化颗粒) 是遵从于中医理论的指导，选用经现代科学实验证实有抑瘤作用的药物组方而成。功能为：益气养阴，清热解毒，化痰止咳。组方药物为：黄芪、沙参、党参、麦冬、桔梗、紫菀、拳参、仙鹤草、白花蛇舌草等。方中黄芪补肺气之不足；党参、甘草补脾和中护胃；沙参、麦冬养肺胃之阴；紫菀、桔梗等利肺降气、化痰止咳，兼以引药入肺经；拳参、白花蛇舌草等清热解毒，解痰湿久蕴之热；仙鹤草止血、止咳，防治伤络咯血，且有益气之功。实验研究和临床观察证明：黄芪、党参有调节机体免疫机能作用，拳参、白花蛇舌草、仙鹤草等有抑制肿瘤的作用。临床治疗195 例晚期原发性肺癌患者，且与144 例化疗病人对照观察， 结果发现：较之化疗，益肺清化颗粒可有效改善患者咳嗽、痰量、 气短、乏力等症状，可有效增强体质、提高生存质量、稳定病 灶、延长生存期，且无明显毒副作用。 3.2 实验基础及理论依据 　　中药血清药理学方法由日本学者Iwama H 于20 世纪80年代首先提出。由于含药血清模拟了体内药物的作用环境，为成分复杂的中药及粗提制剂的药理实验提供了真实可靠的保证，且使中药药理的研究易于深入到细胞分子水平，从而可有效地对成分不明或复方中药制剂进行药效学或药动学研究。因此近20 年来，其已成为中药药理研究的一个热点，在体外实验中得到了广泛的应用，尤其在肿瘤研究中应用颇多。不过，其应用也引起部分学者的异议，因为限于目前的检测手段，含药血清中的具体成分尚难以确定，故给药时间、给药剂量多根据经验确定。本课题根据文献报道方法，结合预实验结果，确定给药方法、血清采集时间及血清处理方法，制备了益肺清化颗粒含药血清，并选择了2 个不同的浓度，体外实验观察对两种不同的肺癌细胞株的抑制作用。结果显示，益肺清化颗粒含药血清具有一定的抑瘤效果，且以较高浓度时抑瘤作用显著。但总体来说，其抑瘤作用要明显弱于化疗药物，说明益肺清化颗粒抗肿瘤转移的机制尚难以完全用对肿瘤细胞的抑杀来解释，提示我们需要从肿瘤发生的机制方面深入探讨益肺清化颗粒的作用机制。