对胃癌术后复发转移及生存期的治疗

研究健脾益肾颗粒对胃癌术后复发转移及生存期的治疗 [关键词] 　胃癌; 肿瘤复发; 转移; 生存期; 健脾益肾方 胃癌患者根治性治疗之后多出现脾气亏虚。此外,患者虽然进行了根治性治疗,但体内仍残存着肿瘤细胞或突变基因,这些突变基因可能先天亏虚所致,日久肿瘤细胞仍会生长繁殖、转移、复发。肾为先天之本,脾胃为后天之本。中国中医科学院广安门医院肿瘤科针对肿瘤患者根治性治疗之后的特点制定了健脾益肾的中医治则。本实验在过去实验和临床研究基础上进一步采用具有淋巴道转移的小鼠前胃癌模型,在小鼠的爪垫皮下移植后,待原发瘤生长到一定大小时手术切除原发瘤,再应用健脾益肾方进行治疗,观察其对局部复发和远处转移的治疗作用及对生存期的影响。 1 　材料和方法 1. 1 　实验动物　 清洁级近交系6～7 周615 小鼠,雌雄各半,体质量18～24 g ,购自中国医学科学院药品鉴定所实验动物中心(动物许可证号SCXK 京200020010 号) 。 1. 2 　瘤株　 小鼠前胃鳞癌细胞,中国医学科学院基础医学研究所病理室用甲基卞基亚硝胺灌胃诱发而成,移植率100 %,传代品系615 小鼠,为具有自发肺转移潜力的高转移细胞株,肺转移率为86 %～90 % ,侵袭周围肌肉组织,中国医学科学院基础医学研究所病理室提供。 1. 3 　药物　 实验用健脾益肾方药为深棕色浸膏,生药浓度2. 24 g/ g。由党参、白术、枸杞子、女贞子、补骨脂、菟丝子组成。制剂由中国中医科学院广安门医院制剂室提供。该方药物组成和剂量同北京长城制药厂生产的已上市的健脾益肾颗粒。阳性对照化疗药物为氟脲嘧啶注射液,10 ml/ 支,0. 25 g/ 支,由上海旭东海普药业有限公司生产。批号:041a008 。 1. 4 　小鼠前胃鳞癌细胞细胞移植　 从液氮中复苏小鼠前胃鳞癌细胞,接种于4 只615 小鼠右腋下,待局部肿瘤长至直径1～1. 5 cm 大小时处死动物,8～12 d 后,无菌取出新鲜生长良好无坏死的肿瘤组织,用生理盐水洗净后,剪碎,加生理盐水用玻璃均浆器研磨成单细胞悬液,过200 目不锈钢筛网,调整细胞数4 ×106 / ml ,台盼蓝拒染试验示活细胞大于95 % ,取0. 05 ml 瘤细胞悬液接种于每只615 小鼠左侧后肢爪垫内侧皮下(移植时避免细胞悬液外溢) 。爪垫皮下移植,是获得淋巴道转移的最佳途径,该模型为肺高转移肿瘤模型[1 ] 。 1. 5 　手术切除原发瘤　 参考文献[ 2 ] ,并进行预实验,发现爪垫皮下肿瘤10 d 时生长明显,侵袭程度达Ⅲ～ Ⅳ[1 ] 。切除局部原发瘤,造成原发瘤切除后,体内仍有残存瘤细胞存在,与临床肿瘤患者在进展期手术切除后的情况相似。手术方法是先用丝线在小鼠小腿下端原发瘤上端结扎紧,再用手术剪从踝关节处切除整个左侧后肢爪垫(即切除原发瘤) ,手术时注意避免切口处流血。 1. 6 　实验分组　 共进行两批实验,第1 批实验在切除原发瘤后,采用随机数字表将60 只小鼠随机分为3 组,每组20 只。(1) 模型组:从术后当日开始,每天给生理盐水0. 3 ml ,连续灌胃15 d。(2) 化疗组:从术后当日给药,给予氟脲嘧啶(52FU) 注射液,按照20 mg/ kg剂量腹腔注射0. 2 ml ,1 次/ d ,连续7 d。同时从术后当日开始,每天给生理盐水0. 3 ml ,连续灌胃15 d。(3) 健脾益肾方治疗组:从术后当日给药,给予健脾益肾方,药物浓度1 g/ ml ,灌胃1 次/ d ,每次0. 3 ml (相当于人临床用量的15 倍) ,连续灌胃15 d。第2 批实验分组和施药方法同第1 批实验,每组15 只。给药结束后, 连续观察至术后60 d[3 ] 。 1. 7 　检查指标　 第1 批实验观察计算荷瘤小鼠术后肺转移抑制率和复发瘤瘤质量抑制率,术后15 d ,颈椎脱臼处死全部小鼠,取肺,4 %甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE 染色,组织学观察肺肿瘤转移情况和转移分级[1 ] ,计算肺转移率;从荷瘤小鼠左下肢剥离复发瘤称重,计算抑瘤率。局部复发瘤是指前胃癌细胞在爪垫皮下接种后10 d ,从踝关节处切除局部原发瘤后,少量残存的瘤细胞又在手术部位不断增殖生长而形成局部复发瘤。转移抑制率= [ 1 - 治疗组转移率( %) / 模型组转移率( %) ] ×100 %;复发瘤瘤质量抑制率= [ 1 - 治疗组复发瘤瘤质量/ 模型组复发瘤瘤质量] ×100 %。第2 批实验观察荷瘤小鼠术后生存期。记录小鼠存活时间,计算各组平均生存时间和中位生存时间,按下列公式计算生命延长率:生命延长率= (治疗组平均生存天数- 模型组平均生存天数) / 模型组平均生存天数×100 %。 1. 8 　统计学方法　 采用SPSS 11. 5 软件进行统计学处理,计量资料用x ±s ,组间比较采用单因素方差分析,多个率的比较采用χ2 检验,等级资料采用多个独立样本秩和检验( Kruskal2Wallis Test ) ,生存期进行Kaplan2Meier 生存分析。 2 　结　果 2.1术后15 d 前胃癌615 小鼠术后肺转移抑制作用 在原发瘤切除后,连续给药15 d ,在术后15 d时全部处死小鼠,检查肺转移情况。模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组肺转移率分别为94. 4 %、73. 7 %和68. 4 %;化疗组转移抑制率为21. 9 % ,健脾益肾方治疗组为27. 5 %。健脾益肾方治疗组和化疗组转移率与模型组相比差异无统计学意义( P > 0. 05) ,但治疗后转移率低于模型组。从转移程度来看,健脾益肾方治疗组和化疗组与模型组相比差异有统计学意义( P < 0. 05) 。说明健脾益肾方对615 小鼠前胃癌术后肺转移有一定的抑制作用,而且可以推迟肺转移。病理切片HE 染色显示:模型组肺内广泛分布10 个以上转移灶,而且有大转移灶存在,整个肺叶由瘤组织取代。健脾益肾方治疗组和化疗组转移灶数量比模型组减少,直径减小,散在分布。 2. 2　术后15 d 前胃癌615 小鼠术后复发瘤抑制作用　 模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组复发瘤瘤质量分别是(1. 01 ±0. 93) 、(0. 26 ±0. 52) 和(0. 35 ±0. 35) g ,健脾益肾方治疗组和化疗组与模型组相比差异有统计学意义( P < 0. 01) 。模型组、化疗组和健脾益肾方治疗组复发率分别是94. 44 %、68. 42 %和78. 95 % , 三组相比差异无统计学意义( P >0. 05) 。健脾益肾方治疗组复发瘤抑制率为65. 35 %,化疗组为74. 26 %。实验结果表明健脾益肾方和52FU均可明显降低前胃癌在615 小鼠下肢局部复发。 2. 3 　前胃癌615 小鼠生存期观察　 与模型组相比,健脾益肾方治疗组与化疗组荷瘤小鼠术后生存期及中位生存期明显延长, 生命延长率为100 %和64. 71 % ,以健脾益肾方治疗组效果更明显。从Kaplan2Meier 曲线图,能清晰看出不同的变化趋势。 3 　讨　论 本课题实验动物选择近交系615 小鼠,其造价低、饲养简便、生命力强,同时考虑还要观察健脾益肾中药对细胞免疫的干预作用,因此未选用裸鼠,有利于推广应用。本课题选用将前胃癌细胞接种于615 小鼠后肢爪垫皮下,有利于研究者肉眼直接观察原发瘤侵袭程度,随时在适当的时间行截肢术,比将肿瘤接种于原位的方法操作简单易行。只要原发瘤结扎紧,截肢后一般出血极少,伤口无需特殊处理,术后1～2 d 恢复完好,此术式对动物损伤小,耐受性好。胃癌的扩散以直接浸润蔓延及淋巴道转移为主,晚期也可发生血行及种植转移。爪垫皮下移植,是获得淋巴道转移的最佳途径,该模型为肺高转移肿瘤模型,较好地模拟了胃癌淋巴转移的方式。建立615 小鼠前胃癌术后复发转移模型也将为评估、规范临床用药及深入研究中医药影响肿瘤转移复发的作用机制奠定基础。 从本研究结果看,健脾益肾颗粒对手术后局部肿瘤复发及肺转移有一抑制作用,虽然转移率和复发率与模型组差异无统计学意义,但对复发和转移程度的控制较模型组差异有统计学意义。健脾益肾颗粒治疗组生存期和生存质量都明显优于模型组和化疗组,术后无论中药治疗期间还是治疗后小鼠毛色光泽,活动灵活,即使出现复发转移时,其状态比模型组和化疗组要好。说明健脾益肾中药具有防治肿瘤复发和转移、提高肿瘤患者生活质量、延长生存期的作用。