胆囊恶性肿瘤的分子生物学研究进展

    　　胆道系统恶性肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。以往曾认为胆道癌为罕见疾病，但是近年来胆道肿瘤发病率有明显上升趋势。胆道癌出现临床症状多属晚期，疗效差，预后不佳。因而对其发病机制的探讨和早期诊断研究正日益引起人们重视。八十年代后期以来，癌基因和抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热门课题，有希望为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一条全新途径。胆道肿瘤的基因研究也逐渐得到人们的关注。
　　迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有 ras（ k－ ras， n－ ras）、 c－ myc、 c－ erbb－2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有 p53、 p16／ mts1、 apc、 dcc等。
　　1　癌基因
　　ras基因是一个常见的癌基因家族，由 k－ ras， n－ ras，和 h－ ras三个成员构成［1］。细胞中正常 ras基因编码高度相关的分子量为21000的蛋白质（ p21）。 p21是一种鸟嘌呤核苷酸（ gtp）结合蛋白，它由188或189个氨基酸组成，和细胞生长和分化密切相关。正常 p21和 gtp结合后激活磷脂酶 c，产生第二信使三磷酸肌醇（ ip3）和二酰甘油（ dg），之后 gtp被 p21降解，第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的 ras基因发生了突变而变成了癌基因，其所编码的变异 p21蛋白仍能同 gtp结合但是失去了降解 gtp的功能，从而使磷酸脂酶 c持续活化，产生大量 ip3和 dg，引细胞过度增殖，最终发生癌变［1］。
　　现在已在人类多种肿瘤中检测到了 ras基因突变［1］。40％的结肠癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可检测到 ras基因的突变。其突变的作者单位：中国医科大学第二临床学院肝胆外科（沈阳110003）崔健现在上海医科大学中山医院肝癌研究所（200032）主要方式是点突变，12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中 k－ ras基因的突变率高达90％以上，而且突变的位点大多局限于 k－ ras基因12位点上［2］。但是对于胆系肿瘤，关于 ras基因突变研究文献极少，而且结果差异很大，甚至还有完全相反的报道［3～5］。
　　almoguera应用 rna酶错配切割法和 dna直接测序，分析胆道肿瘤的病理标本时，未见任何 ras基因改变［2］。而 tada等应用 dna测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有 ras基因突变，在胆囊癌中则不存在 ras基因改变［3］。与之相反， levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛 ras基因点突变［4］。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中 k－ ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在 k－ ras基因改变，而是检测方法灵敏度不够所致。 dna直接测序时，大约需要20％的细胞发生突变才能得到阳性结果，而 rna酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为，由于胆道肿瘤是多克隆发病，因而发生 k－ ras基因突变的细胞只是一小部分，用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步 pcr－ rflp法（两轮碱基错配 pcr＋两轮限制性核酸内切酶酶切）配以 dna直接测序，发现肝外胆管癌中 k－ ras基因突变率为100％。这种方法灵敏度非常高，可以在512个等位基因中检测到一个基因的点突变。
　　watanabe等应用与 levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本［5］。结果发现55％的胆囊癌、100％的肝外胆管癌均存在 k－ ras基因改变。总的突变率为75％。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是 g→ a，使 ggt变成了 gat，所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生 ggt→ gtt及 ggt→ ttt改变，这些都导致了相应氨基酸改变，因而均是有意义突变。更为重要的是，他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中，表面正常的腺瘤已经发生了 k－ ras基因突变，而且突变方式和癌组织完全一样，从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。
　　ajiki等的研究亦表明 k－ ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象［6］。在他们的研究中，胆囊癌、胆管癌、胆囊上皮不典型增生的 k－ ras基因12位点的点突变率分别为57％、59％、73％。他们的实验也发现了一个很有意义的现象：9例发生在胆囊癌周围的不典型增生，都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素（如：胆石、长期胆汁酸刺激等）的作用下，胆囊粘膜肠上皮化生→胆囊粘膜不典型增生→胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。
　　yukama等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展期胆囊癌中 ras基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中 ras基因产物 p21阳性表达率高达95％。胆囊炎为33％。其他癌基因产物如 c－ myc、 c－ erbb2、表皮生长因子（ egf）、转化生长因子受体（ tgf－β）等在胆囊癌都有高表达，平均阳性率在60％左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低，平均在10％以下［7］。 lee等的研究结果也表明，与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比，胆囊癌中 p21呈现强表达，阳性率为62％，胆管癌中 p21阳性率也达到了50％。 p21表达和预后没有明显的关系［8］。以上学者都认为：胆囊癌发病过程中存在着多种基因共同作用，其中， ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与 ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的［9］。
　　c－ erbb2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体（ egfr）类似物。对于它的研究结果不尽相同。 kamel等的研究结果表明胆囊癌中 c－ erbb2·35·肝胆胰外科杂志1999年第11卷第1期阳性率大约为10％。胆囊粘膜不典型增生中，其阳性率为0。他们认为 c－ erbb2表达在胆囊癌中是一较晚事件，只有在细胞癌变后才出现［10］。而 yukama等的研究表明 c－ erbb2在早期胆囊癌中阳性表达率为69％。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为 c－ erbb2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一［7］。出现这一不同结果的原因可能是：1．他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。2．所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于 c－ erbb2在胆囊癌发生中到底起何种作用，仍需进一步研究。
　　2　抑癌基因
　　关于抑癌基因，目前研究最多的是 p53基因。 p53定位于人染色体17p13，全长为16－20kb，由11个外显子构成。正常 p53基因编码野生型 p53蛋白，是一种分子量为53kd的核内磷蛋白。人的 p53蛋白由393个氨基酸组成。 p53基因突变后所编码的蛋白称为变异型 p53。
　　在人乳腺癌、脑瘤、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现 p53基因突变，总突变率为50％左右［11～13］。其中83％为错义点突变，6％为无义点突变，10％为插入或缺失突变。 p53的突变并非随机发生，大多数的突变发生于133－299氨基酸。应用 pcr技术研究后发现密码子132－145、171－179、239－248、272－286为突变热点。
　　野生型 p53蛋白的主要功能是：抗细胞增殖，抑制细胞生长分裂，使细胞停止于 g1期而不进入 s期。野生型 p53可以阻碍 dna复制起始复合物的装配，抑制 dna复制，并且在转录水平进行调节，防止细胞过度生长分裂。此外野生 p53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型 p53基因失活的细胞经久处于未成熟状态，持续增生。突变型 p53则不具备以上的功能。
　　野生型 p53蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型 p53则很稳定，可以在核内积聚，这使得可以用免疫组织化学方法检测到它的存在［14］。突变型 p53的检测可以很好反映 p53基因突变情况［15］。这一点不同于 ras基因。 wee等用 s－ p法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中 p53蛋白表达，阳性率分别为73％和64％［16］。他们认为在胆道癌发病过程中， p53基因突变是一个普遍发生的事件，是胆道癌发生内在因素之一。 kamel［10］等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着 p53基因突变。更为重要的是，在两例胆囊上皮不典型增生的标本中，他们也发现了 p53蛋白阳性表达。
　　hanada等研究发现，在病理类型为平坦型的胆囊癌中， p53阳性率高于息肉型胆囊癌。而平坦型癌多为浸润癌［17］。 roa的研究也表明，在早期胆囊癌中， p53的阳性率为23．5％，在进展期胆囊癌中， p53的阳性率达到48．2％。在高分化胆囊癌中， p53的阳性率为25％，而在低分化的胆囊癌中， p53的阳性率达到50％［18］。以上研究均提示 p53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
　　p16是近年发现的比 p53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因，又称为多肿瘤抑制基因（ mts1）。 p16基因定位于人染色体9p21，由三个外显子构成。总长度为8．5kb。其编码产物 p16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者［19］。它是细胞周期依赖性激酶4（ cdk4）抑制因子。因而又称 mts1／ p16／ cdk4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶（ cdks）的活化， cdk4和 d型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从 g1→ s期的转变，从而促进细胞增生，这可能是恶性肿瘤发生因素之一。 p16蛋白能和 cdk4结合，抑制细胞转化。近年来有关 p16基因纯合性丢失的研究表明，在人类大部分肿瘤中，均有 p16纯合性丢失，与杂合性丢失一起，总的突变率为50％。碱基突变和缺失另占25％，故在肿瘤组织中 p16总突变率为75％，比 p53的50％的突变率高得多。
　　1995年， yoshida等人世界上首次报告了 p16基因在胆道肿瘤中的突变情况［20］。他们分析了25例胆道肿瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中 p16／ mts1的总突变率为64％（其中胆囊癌80％，胆管癌63％），高于 p53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中， p16可能比 p53起更重要的作用。但是 p16在胆系肿瘤中到底作用如何，具体突变方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一个明确结论。
　　apc基因和 dcc基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，编码产物分子量超过300，000，调控 ras基因表达。后者也位于5q21，在 apc附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变［21］，但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q［21，22］缺失，故认为 apc和 dcc与胆管癌关系不大［22］。
　　3　前景和展望
　　虽然对于胆系肿瘤的分子生物学研究与胃癌、结直肠癌和胰腺癌相比仍不够深入，众多的问题还有待于解决，但是目前的研究结果大大丰富了我们对于胆系肿瘤的认识，这对于寻找早期诊断胆系肿瘤的有效手段具有重要的指导价值。
　　胆道肿瘤发病率近年明显上升。由于早期诊断困难，故预后极差。寻找一条有效的早期诊断手段是当前研究的重要课题。从胰腺癌的研究中我们可以获得一些启发。1990年 shibata对36例胰腺癌标本作细胞学检查的同时作 k－ ras基因突变分析，结果25例细胞学检查恶性标本中18例测到了 ras基因点突变［23］。3例细胞学检查良性标本无一例发生 ras基因突变。8例细胞学检查为不典型增生标本中，有两例发生突变。1991年， tada等对 b超引导下胰腺穿刺所获得的细胞进行基因分析，检测 k－ ras基因12位点的突变，成功地为2例细胞学检查无法判定病变良恶性的病例作出了诊断［24］。随着研究方法的不断改进，特别是改良的二步 pcr－ rflp方法的应用，人们发现胆道肿瘤中也广泛存在着 k－ ras基因12位点的突变，总突变率在75％～100％之间，接近于胰腺癌突变水平。由于 pcr技术灵敏性和特异性极高，可以从几个拷贝的 dna分子中检测到 k－ ras基因点突变，因而用十二指肠引流或 ptcd检查获得胆汁中的脱落细胞，或在 b超引导下用细针穿刺胆道肿瘤获得标本，然后用 pcr法检测标本中 k－ ras基因12位点突变，有可能开创一条早期诊断胆道肿瘤的新途径，而且对于常规影像学和细胞学检查有重要补充价值。