鼻咽癌细胞株

　　1.6 统计学处理 所有实验重复4次。所得数据经SPSS 10.0 for windows 软件处理，结果用±s表示，用t检验和方差分析。

　　1.5.2 PI分析细胞周期 收集不同组细胞，70%冷乙醇固定过夜，RnaseA 37?℃水浴消化30?min，PI避光染色30?min，上流式细胞仪检测细胞周期分布。

　　1.5.1 实验分组 将增殖良好并处于对数生长期的CNE?2细胞制成细胞悬液，随机分成4组：（1） 空白对照组：不加药物及不作照射，单纯培养液培养24?h；（2） 药物治疗组：加入含100?μmol/L冬凌草甲素的培养液中培养24?h；（3） 照射治疗组：照射6?Gy，单纯培养液培养24?h；（4） 联合治疗组：加入含100?μmol/L冬凌草甲素的培养液培养24?h后更换为单纯培养液；再照射6?Gy，单纯培养液培养24?h。

??1.5 流式细胞分析

??1.4 克隆形成实验测定药物放射增敏性 分为单纯照射组和药物+照射组，后者在照射前予以冬凌草甲素100?μmol/L，培养箱内培养24?h。照射剂量分别为0、2、4、6、8、10?Gy。胰酶消化，计数细胞数，逐级稀释后将细胞接种在塑料平皿中。在培养箱内开放培养14?d。然后取出培养皿，弃去培养液，PBS清洗2遍，甲醇固定15?min，去除固定液，姬姆萨染色30?min，对含50个细胞以上的克隆进行计数，计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数D0、Dq、N值。最后求放射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER), 公式如下：SER=单纯照射组D0值比药物+照射组D0值。

??1.3 照射条件 使用6MV X线直线加速器照射，照射距离为100?cm，照射野为10?cm×10?cm大，室温下单次照射。

??1.2 细胞培养 细胞培养基RPMI1640（美国Gibco BRL公司），补充10%胎牛血清（杭州四季青公司）、100?IU/ml青霉素和0.1?mg/ml链霉素。置于37?℃、5%CO2培养箱在全湿条件下培养。

??1.1 细胞株、药物和试剂 人鼻咽癌细胞株CNE?2细胞购于中国科学院上海细胞生物所，冬凌草甲素（纯度＞98%）购于中国科学院昆明植物研究所，PI（碘化丙啶）购于Sigma公司，流式细胞仪为Beckman Coulter公司产。

??鼻咽癌是我国南方最常见的头颈部恶性肿瘤之一，病理类型以低分化鳞状细胞癌多见，临床治疗以放疗为主，晚期患者辅以化疗。与传统的化疗药物相比，天然抗肿瘤药物日益受到人们的关注［1］。我们先前的研究表明，冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE?2细胞具有明显的抑制作用［2］，但对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响如何？本实验将冬凌草甲素联合放疗应用于人鼻咽癌细胞株CNE?2细胞，通过克隆形成实验、流式细胞分析等观察冬凌草甲素的放射增敏作用及其可能机制，以期为临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法